• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    選擇性培養(yǎng)基結(jié)合特異引物法分離鑒定家兔腸道脆弱擬桿菌*

    2015-04-18 10:54:24張煜坤張曉霄徐秀容
    家畜生態(tài)學(xué)報(bào) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:家兔菌液選擇性

    張煜坤,張曉霄,徐秀容*

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌712100;2. 鹿兒島大學(xué)農(nóng)學(xué)部,日本 鹿兒島890-0065)

    ?

    選擇性培養(yǎng)基結(jié)合特異引物法分離鑒定家兔腸道脆弱擬桿菌*

    張煜坤1,張曉霄2,徐秀容1*

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌712100;2. 鹿兒島大學(xué)農(nóng)學(xué)部,日本 鹿兒島890-0065)

    脆弱擬桿菌作為嚴(yán)格厭氧菌,對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻,分離培養(yǎng)有較大難度。試驗(yàn)通過(guò)改進(jìn)的選擇性培養(yǎng)結(jié)合特異引物方法分離兔源脆弱擬桿菌,并利用16 s rDNA測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定,為后續(xù)研究其與宿主關(guān)系奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)從健康青年家兔腸道中采集內(nèi)容物,先接種于含液態(tài)選擇性培養(yǎng)基的厭氧管中,進(jìn)行富集培養(yǎng)1~2 d,然后將培養(yǎng)的菌液稀釋后接種到選擇性培養(yǎng)基平板上,于厭氧罐中培養(yǎng)1~3 d,待長(zhǎng)出菌落后,觀察菌落形態(tài),挑選符合脆弱擬桿菌菌落特點(diǎn)的單一菌落,培養(yǎng)后提取DNA,以脆弱擬桿菌特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。對(duì)擴(kuò)增出特異條帶的菌株,擴(kuò)增其16 s rDNA序列,并進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中脆弱擬桿菌序列進(jìn)行比對(duì),以鑒定分離的菌株。結(jié)果表明,細(xì)菌為大小不一的桿菌,革蘭氏染色呈陰性。特異引物PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)顯示,挑取的27株單一菌落中,有7株可以擴(kuò)增出符合目的片段大小的產(chǎn)物。隨機(jī)選取兩株進(jìn)行16s rDNA測(cè)序,其序列與GenBank中的遞交的脆弱擬桿菌序列相似度大于99%,與其他細(xì)菌相似度均小于93.43%,可確定分離到的菌株為脆弱擬桿菌。

    家兔;脆弱擬桿菌;分離;鑒定

    腹瀉是威脅家兔健康的主要疾病,尤其是斷奶仔兔,養(yǎng)殖中60%~70%的健康問(wèn)題是由腹瀉引起,而且腹瀉引起的死亡可高達(dá)80%。目前,由于使用抗生素帶來(lái)的食品安全和抗藥性等問(wèn)題,使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注抗生素替代品的研究和應(yīng)用,這些替代品包括各種益生菌。與豬和雞等其他單胃動(dòng)物不同,家兔腸道中優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌,乳酸菌數(shù)量很少,而且沒(méi)有檢測(cè)到雙歧桿菌[1-2]。脆弱擬桿菌對(duì)人和大多數(shù)動(dòng)物是一種常見(jiàn)的厭氧病原體[3-5],但作為家兔腸道尤其是盲腸中的主要優(yōu)勢(shì)菌,對(duì)家兔盲腸發(fā)酵及腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育等可能起著重要的作用,分離兔源脆弱擬桿菌將為這些基礎(chǔ)研究創(chuàng)造條件,繼而為開(kāi)發(fā)家兔特異益生菌研究提供理論依據(jù)。脆弱擬桿菌為嚴(yán)格厭氧菌,通過(guò)焦性沒(méi)食子酸降低干燥器內(nèi)氧分壓改進(jìn)簡(jiǎn)易厭氧裝置,為無(wú)厭氧設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格厭氧菌的培養(yǎng)創(chuàng)造條件。目前特定菌種的分離多采用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基方法,然后通過(guò)生化形態(tài)鑒定其種屬,但傳統(tǒng)的鑒定方法不僅過(guò)程繁瑣,而且準(zhǔn)確性較差,近年來(lái)分子技術(shù)在細(xì)菌分類(lèi)上的應(yīng)用研究結(jié)果顯示,菌落形態(tài)和生化反應(yīng)相同的細(xì)菌可能屬于不同的菌種。利用選擇性培養(yǎng)基方法結(jié)合特異引物PCR方法,可以更快速更準(zhǔn)確地分離目的菌種。James等[6]篩選出脆弱擬桿菌的選擇性培養(yǎng)基,并用此培養(yǎng)基分離到脆弱擬桿菌。盡管在該培養(yǎng)基中添加了慶大霉素及促擬桿菌生長(zhǎng)的成分,提高了脆弱擬桿菌的檢出率,但分離出的菌株并非都是脆弱擬桿菌。Joseph等[7]根據(jù)脆弱擬桿菌的Leu基因設(shè)計(jì)了脆弱擬桿菌的特異性引物,利用該引物進(jìn)行熒光定量PCR,對(duì)腸道中脆弱擬桿菌進(jìn)行定量分析,定量結(jié)果均與實(shí)際結(jié)果一致,可以準(zhǔn)確的分析出樣品中脆弱擬桿菌的數(shù)量。目前該特異引物主要用于檢測(cè)糞便[8-11]及水體污染[12-14]樣品中脆弱擬桿菌的數(shù)量,還沒(méi)有將其用于脆弱擬桿菌分離鑒定的研究報(bào)道。由于脆弱擬桿菌嚴(yán)格厭氧,因此從動(dòng)物腸道中分離該菌以及通過(guò)生化培養(yǎng)鑒定都比較困難,尤其在無(wú)特定厭氧裝置的情況下。因此本研究設(shè)計(jì)出快捷的分離和鑒定兔源脆弱擬桿菌的方法,為脆弱擬桿菌在家兔腸道中的功能研究以及家兔特異益生菌開(kāi)發(fā)等提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 簡(jiǎn)易厭氧罐

    本試驗(yàn)采用干燥器法。該方法造價(jià)低,操作較方便,密封性較好。利用焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉反應(yīng)消耗氧氣的特點(diǎn),快速創(chuàng)造厭氧環(huán)境。厭氧環(huán)境的創(chuàng)造方法:計(jì)算干燥器體積,根據(jù)其體積(1 000 mL空間用焦性沒(méi)食子酸10 g,用10%氫氧化鈉溶液100 mL)稱(chēng)取焦性沒(méi)食子酸和配制氫氧化鈉溶液;然后將氫氧化鈉溶液倒人干燥器底部,盛有焦性沒(méi)食子酸的平皿輕輕浮于液面之上,放好隔板,將接種好的平板置于隔板上,并在隔板上點(diǎn)燃一支蠟燭,把干燥器蓋蓋上密封。輕輕搖動(dòng)干燥器,使焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉溶液混合并反應(yīng),待蠟燭熄滅后置于37 ℃培養(yǎng)箱。

    1.2 試驗(yàn)用選擇性培養(yǎng)基制備與養(yǎng)分優(yōu)化

    選擇性培養(yǎng)基需促進(jìn)脆弱擬桿菌生長(zhǎng)繁殖并抑制其他菌的生長(zhǎng),本研究采用的FRAG選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)James等[6]試驗(yàn)配方進(jìn)行養(yǎng)分優(yōu)化。優(yōu)化方法是增加血紅素、維生素K和吐溫80以促進(jìn)脆弱擬桿菌生長(zhǎng);脆弱擬桿菌抗慶大霉素、耐膽鹽,添加慶大霉素抑制非抗性菌,加入膽鹽抑制不耐膽鹽的微生物生長(zhǎng)。

    1.3 選擇性培養(yǎng)基的厭氧優(yōu)化

    按文獻(xiàn)[15]所示方法選擇培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧優(yōu)化處理:(1) 添加0.05%~0.1%的瓊脂(可減少分子氧的溶解,維持氧化還原電勢(shì)(Eh));(2)添加0.5% L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5~1.0%葡萄糖和硫酸亞鐵溶液等還原劑以降低氧分壓;(3)培養(yǎng)基煮沸10~15 min以去除較多溶解氧。FRAG 選擇性培養(yǎng)基組成與配制:準(zhǔn)確稱(chēng)量表1各種成分(慶大霉素待滅菌后冷卻至約55 ℃再加入),補(bǔ)水至100 mL,用 l mol/L 的NaOH溶液調(diào)整pH至7.2~7.4。配制好培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入?yún)捬豕?,并根?jù)厭氧管大小通入足夠無(wú)氧氮?dú)猓缓笤?21 ℃下滅菌20 min。滅菌后在液體培養(yǎng)基上加1~2 cm厚的液體石蠟,密封備用。固體選擇培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上每100 mL中加1.5 g瓊脂,滅菌后在厭氧罐中冷卻至55 ℃加入慶大霉素,充分混勻后鋪平板。平板快速放入?yún)捬豕拗欣鋮s凝固備用。

    表1 FRAG 培養(yǎng)基組成

    注:①100 mL水中加下列成分配成礦物溶液: NaCl, 9.0 g; CaCl2.2H2O, 0.27 g;MgCl2.6H20, 0.2 g; MnCl2.4H20, 0.1 g; and CoCl2.6H20,0.1 g。此溶液4 ℃保存。②100 mL水中加0.04 g FeS04.7H20配成硫酸亞鐵溶液,4 ℃保存。

    Notes:①The mineral solution contained the following in 100 ml of water: NaCl, 9.0 g; CaCl2.2H2O, 0.27 g;MgCl2.6H20, 0.2 g; MnCl2.4H20, 0.1 g; and CoCl2.6H20,0.1 g. This solution was stored at 4 ℃. ②The FeSO4solution contained 0.04 g of FeS04.7H20 in 100 ml of water and was stored at 4 ℃.

    1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

    健康的青年家兔3只,供采集腸道內(nèi)容物。14日齡和30日齡(斷奶)健康仔兔各30 只,供毒性檢測(cè)試驗(yàn)。

    1.5 試驗(yàn)方法

    1.5.1 樣品采集及細(xì)菌培養(yǎng) 試驗(yàn)兔耳緣靜脈注射空氣處死,迅速打開(kāi)腹腔,分離結(jié)扎各個(gè)腸段,無(wú)菌操作,迅速采集盲腸內(nèi)容物。

    無(wú)菌條件下將采集的內(nèi)容物迅速接種到厭氧管底部,37 ℃恒溫培養(yǎng)1~2 d,再將培養(yǎng)的菌液梯度稀釋?zhuān)臃N到含固態(tài)選擇培養(yǎng)基的平板上,在厭氧罐中37 ℃恒溫培養(yǎng)2~3 d。

    1.5.2 菌落觀察與挑純 待長(zhǎng)出菌落后,觀察各平板上菌落生長(zhǎng)的形態(tài),結(jié)合鏡檢,篩選出優(yōu)勢(shì)菌株,進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離純化,以保證分離到單一菌株。

    1.5.3 菌株的鑒定 對(duì)所分離的優(yōu)勢(shì)菌株,挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢。

    特異引物法鑒定:將鏡檢符合脆弱擬桿菌的菌落在液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并提取DNA,以脆弱擬桿菌的特異引物L(fēng)eu-f/ Leu-r(CACTTGACTGTTGTAGATAAAGC/CATCTTCATTGCAGCAT TATCC)[7](目的片段為135 bp)進(jìn)行PCR,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

    16S rDNA測(cè)序進(jìn)一步鑒定:隨機(jī)選取2株經(jīng)特異引物鑒定為陽(yáng)性的菌株提取細(xì)菌DNA,用16S rDNA通用引物Eubac 27F/Eubac 1492R(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/CGGTTACCT TGTTACGACTT)[19]進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用NCBI中的BLAST軟件與GenBank中的16srDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。

    1.5.4 分離菌株對(duì)家兔毒性試驗(yàn) 將保存菌液活化培養(yǎng)后,充分混勻,取0.1 mL分別接種于含5.0 mL厭氧菌培養(yǎng)基的厭氧管中,37 ℃恒溫培養(yǎng)。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定菌液濃度,然后測(cè)定不同濃度菌液的OD值,利用菌液OD值與菌液濃度關(guān)系計(jì)算細(xì)菌含量。

    選擇無(wú)疫情、飲水無(wú)病原菌污染的陰性兔場(chǎng)。隨機(jī)選取14日齡和30日齡(斷奶)體況相近健康仔兔各30 只,分別隨機(jī)分為A、B、C 3組。試驗(yàn)期為10 d,飼料中不添加抗生素及微生態(tài)制劑,每天11∶00~11∶30灌服菌液。A組灌服無(wú)菌培養(yǎng)基,B組灌服含1×108脆弱擬桿菌菌液,C組灌服2×108脆弱擬桿菌菌液。觀察各組幼兔糞便的變化及臨床反應(yīng),記錄健康和死亡情況;稱(chēng)重,記錄體重變化。

    2 結(jié) 果

    2.1 選擇性培養(yǎng)基分離與形態(tài)鑒定

    稀釋的內(nèi)容物接種在液體選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h可見(jiàn)厭氧管底部有少量渾濁,24 h渾濁度明顯增加。將該菌液稀釋接種于固體平板選擇性培養(yǎng)基12 h后可見(jiàn)到菌落長(zhǎng)出,24~36 h可挑單一菌落。

    從圖1可看出,通過(guò)嚴(yán)格厭氧和優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌,革蘭氏染色呈陰性,菌體為長(zhǎng)短不一的多形性的桿菌,與脆弱擬桿菌相似。

    2.2 特異引物擴(kuò)增分析

    從圖2可以看出,以脆弱擬桿菌特異引物L(fēng)eu-f/ Leu-r為引物,以提取的細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR,27個(gè)菌落中有7個(gè)菌落獲得了大于100 bp小于250 bp的單一特異條帶,與目的片段(135 bp)長(zhǎng)度相符。

    圖1 細(xì)菌革蘭氏染色 (×1000)

    圖2 細(xì)菌DNA PCR產(chǎn)物電泳圖像

    2.3 16S rDNA測(cè)序鑒定

    經(jīng)過(guò)活力篩選后,選出兩株活力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)GenBank (登錄號(hào)KF706546,KF727478)。序列比對(duì)分析結(jié)果(表2)顯示,被鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank中的已有脆弱擬桿菌16S rDNA序列相似性大于99%,而與最相近的非脆弱擬桿菌16S rDNA序列相似性小于93.43%,可確定所分離的菌株為脆弱擬桿菌。

    2.4 毒性檢測(cè)結(jié)果

    分別從14日齡和30日齡開(kāi)始灌服的各組幼兔糞便無(wú)異常、采食正常、精神良好,各處理組均沒(méi)有病變和死亡仔兔。14~24日齡和30~40日齡各處理組間ADG差異均不顯著(P<0.05)。

    3 討 論

    3.1 培養(yǎng)條件的控制

    脆弱擬桿菌為中度厭氧菌,可在2%~8%氧分壓(平均3%)下生長(zhǎng),在空氣中暴露60~90 min會(huì)死亡[15],因此脆弱擬桿菌的培養(yǎng)以快速取樣和嚴(yán)格厭氧為核心。首先是創(chuàng)造厭氧培養(yǎng)環(huán)境。專(zhuān)業(yè)的厭氧培養(yǎng)箱或者工作站價(jià)格昂貴,操作與維護(hù)復(fù)雜,在分析了所培養(yǎng)厭氧菌的要求后設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)易培養(yǎng)罐適合小型實(shí)驗(yàn)室及野外采樣等少量培養(yǎng)。焦性沒(méi)食子酸和氫氧化鈉溶液反應(yīng)后可吸收大量氧氣,加上蠟燭的燃燒耗氧,可使罐內(nèi)氧分壓達(dá)到脆弱擬桿菌的生長(zhǎng)要求。其次,需優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基養(yǎng)分。脆弱擬桿菌抗慶大霉素,添加慶大霉素可抑制非抗性菌生長(zhǎng);脆弱擬桿菌耐膽鹽,培養(yǎng)基中加入20%膽汁或2 g/L 膽鹽可促進(jìn)本菌生長(zhǎng),抑制不耐膽鹽的微生物;本試驗(yàn)還添加了0.02%吐溫80,增加了維生素K、氯化血紅素促進(jìn)其生長(zhǎng)。選擇性培養(yǎng)基的厭氧優(yōu)化也是促進(jìn)脆弱擬桿菌生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵。培養(yǎng)基煮沸可去除較多溶解氧,煮沸10~15 min可使Eh降低至10~100 mV;添加0.5%L-半胱氨酸鹽酸鹽、0.5~1.0%葡萄糖等還原劑及硫酸亞鐵溶液可降低Eh;添加0.05%~0.1%的瓊脂可減少分子氧的溶解,維持Eh;接種時(shí)接種在培養(yǎng)基底部有利于厭氧菌生長(zhǎng);在液體培養(yǎng)基上加1~2 cm厚的液體石蠟隔絕氧的溶解;配制好培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入?yún)捬豕?,通入足夠無(wú)氧氮?dú)馀懦隹諝猓瑴p小氧分壓,條件允許情況下接種等步驟可在氮?dú)獗Wo(hù)下進(jìn)行。

    表2 序列比對(duì)結(jié)果

    表3 灌服脆弱擬桿菌對(duì)仔兔平均日增重的影響

    由于液態(tài)培養(yǎng)基中的氧分壓要低于平板培養(yǎng)基表面,因此平板培養(yǎng)分離單菌落前,先用液態(tài)選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),可提高目的菌種的數(shù)量和比例。

    3.2 鑒定方法

    傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是根據(jù)菌落形態(tài)、鏡檢和系列生化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷,鑒定過(guò)程繁瑣,而且隨著分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌鑒定上的應(yīng)用發(fā)現(xiàn),具有相同菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)果和生化反應(yīng)的細(xì)菌,可能不屬于同一種細(xì)菌,這說(shuō)明傳統(tǒng)鑒定方法存在局限性。由于細(xì)菌16s rDNA序列中的可變區(qū)域變異速度較快,不同菌種間往往存在差異,因此16srDNA序列測(cè)定方法成為鑒定細(xì)菌菌種的重要方法。本研究在鏡檢基礎(chǔ)上,先利用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的脆弱擬桿菌特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè),然后對(duì)能夠擴(kuò)增出特異片段的菌株進(jìn)行16srDNA序列測(cè)定,可快速篩選出目的菌種。

    在本研究中用脆弱擬桿菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的、具有脆弱擬桿菌菌落特點(diǎn)和鏡檢特點(diǎn)的27個(gè)菌株中只有7個(gè)菌株屬于脆弱擬桿菌。這說(shuō)明,相關(guān)研究推薦的脆弱擬桿菌選擇性培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌并非為單一的脆弱擬桿菌。

    4 結(jié) 論

    簡(jiǎn)易厭氧罐和厭氧管在嚴(yán)格的厭氧控制下可有效培養(yǎng)擬桿菌類(lèi)厭氧菌。優(yōu)化的選擇培養(yǎng)基可降低氧化還原電勢(shì),促進(jìn)厭氧菌生長(zhǎng),但該選擇性培養(yǎng)基并非為脆弱擬桿菌的專(zhuān)一性培養(yǎng)基,而脆弱擬桿菌特異引物PCR方法可以排除其中非脆弱擬桿菌;16s rDNA序列測(cè)序結(jié)果可鑒定本試驗(yàn)分離到的脆弱擬桿菌。本試驗(yàn)分離的脆弱擬桿菌菌株對(duì)家兔無(wú)致病致死等毒副作用,且對(duì)家兔日增重?zé)o影響。

    [1] Gouet P,Fonty G.Changes in the digestive microflora of holoxenic rabbits from birth until adulthood[J].Annales de Biologie Animale Biochimie Biophysique,1979,19:553-566.

    [2] Boulahrouf A,Fonty G,Gouet P.Establishment,counts, and identification of the fibrolytic bacteria in the digestive tract of rabbit-Influence of feed cellulose content[J].Current Microbiology,1991,22:1-25.

    [3] Duerden B.Virulence factors in anaerobes [J].Clinical Infectious Diseases,1994,18(S4): 253-259.

    [4] Falagas M,Siakavellas E.Bacteroides,prevotella,and porphyromonas species:a review of antibiotic resistance and therapeutic options [J].International Journal of Antimicrobial Agents,2000,15:1-9.

    [5] Jousimies-Somer H, Summanen P, Citron D, et al.Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual[M].6th ed. Belmont, CA:Star Publishing Company, 2002.

    [6] James M,Busch E,Blazevic D.Medium for selective isolation and presumptive identification of the Bacteroides fragilis group[J].Journal of Clinical Microbiology,1982,15(1):123-129.

    [7] Joseph P,Victoria M.Comparative evaluation of conventional and real-time PCR assays for detecting bacteroides fragilis in clinical samples[J].Journal of Clinical Microbiology.2013, 51(5):1 593-1 595.

    [8] Merino V,Nakano V,Liu C,et al.Quantitative detection of enterotoxigenic Bacteroides fragilis subtypes isolated from children with and without diarrhea [J].Journal of Clinical Microbiology, 2011,49:416-418.

    [9] Akpmar M,AktaE,C?mert F, et al.Evaluation of the prevalence of enterotoxigenic Bacteroides fragilis and the distribution bft gene subtypes in patients with diarrhea[J].Anaerobe,2010,16:505-509.

    [10] Durmaz B,Dalgalar M,Durmaz R.Prevalence of enterotoxigenic Bacteroides fragilis in patients with diarrhea: a controlled study [J].Anaerobe,2005,11:318-321.

    [11] Zhang G,Svenungsson B,K?rnell A,et al.Prevalence of enterotoxigenic Bacteroides fragilis in adult patients with diarrhea and healthy controls [J].Clinical Infectious Diseases, 1999,29:590-594.

    [12] Lee C,Lee J.Evaluation of new gyrB-based real-time PCR system for the detection of B. fragilis as an indicator of human-specific fecal contamination[J].Journal of Microbiological Methods, 2010, 82:311-318.

    [13] Lee C,Marion J,Lee J.A novel genetic marker for the rapid detection of Bacteroides fragilis in recreational water as a human-specific faecal indicator[J].Journal of Water and Health,2011,9:253-264.

    [14] Siefring S,Varma M,Atikovic E, et al.Improved real-time PCR assays for the detection of fecal indicator bacteria in surface waters with different instrument and reagent systems[J].Journal of Water and Health,2008,6:225-237.

    [15] 叢玉龍.醫(yī)家金鑒-檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)卷(下冊(cè))[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2007.

    [16] 農(nóng)業(yè)部厭氧微生物重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室《產(chǎn)甲烷細(xì)菌及研究方法》編著組. 產(chǎn)甲烷細(xì)菌及研究方法[M].成都:成都科技大學(xué)出版社, 1999.

    [17] 閔 航.厭氧微生物學(xué)[M].浙江:浙江大學(xué)出版社,1993.

    [18] 中國(guó)科學(xué)院微生物所《菌種保藏手冊(cè)》編著組.菌種保藏手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1980.

    [19] Claudia M,Jaime R,Romilio T.Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology, 2002, 148: 1233-1239.

    Isolation and Identification of Rabbit IntestinalBacteroidesFragilisby Selective Medium Combining with Specific Primers

    ZHANG Yu-kun1,ZHANG Xiao-xiao2,XU Xiu-rong1*

    (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.FacultyofAgriculture.KagoshimaUniversity,Kagoshima890-0065,Japan)

    As a strictly anaerobic acterium,Bacteroidesfragiliswas difficult to isolate and cultivate because of the strict growing condition. This experiment was conducted to isolate and identify rabbit originalBacteroidesfragilisby combining specific culture medium and molecular techniques. The isolated rabbit originalBacteroidesfragiliswill provide the material to further research on the relationships between bacteria and its host. The intestinal content was collected from healthy young rabbit and inoculated to the liquid selective medium in anaerobic tube, and cultured for 1-2 days. Subsequently, the cultured bacteria were inoculated to the plate culture medium and cultured for 1-3 days in a simple anaerobic jar. After colonies were formed, 27 colonies were picked out from it, and then one part of each colony was used for preservation and the remaining was cultured to extract genomic DNA for PCR detection usingBacteroidesfragilisspecific primers. Finally, 16s rDNA sequences of the PCR-positive colonies were cloned using universal primers and sequenced. There were 7 strains withBacteroidesfragilisspecific bands when detecting the PCR products. Aligning the 16s rDNA sequence of these strains with the database in GenBank showed that it has more than 99 % similarity with the 16s rDNA sequence ofBacteroidesfragilisin GenBank and the highest similarity with other bacteria is 93.43%.

    rabbits;Bacteroidesfragilis; isolation; identification

    2014-10-09,

    2014-11-28 [基金項(xiàng)目] 陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013K02-18);西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(QN2011061)

    張煜坤(1989-),男,河北張家口人,碩士,主要從事動(dòng)物腸道微生物與免疫營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail:zhangyukun672@163.com

    *[通訊作者] 徐秀容(1969-),女,湖北英山人,副教授,碩士生導(dǎo)師。E-mail:xuxiurong@yahoo.com

    S811.6

    A

    1005-5228(2015)03-0058-05

    猜你喜歡
    家兔菌液選擇性
    多糖微生物菌液對(duì)油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    家兔“三催”增效飼養(yǎng)法
    Bonfire Night
    鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中通過(guò)吸光度值測(cè)定菌液濃度的方法研究
    選擇性聽(tīng)力
    家兔常見(jiàn)皮膚病的防治
    家兔便秘的防治辦法
    復(fù)合微生物菌液對(duì)黃瓜生長(zhǎng)和抗病蟲(chóng)性效應(yīng)研究
    上海蔬菜(2015年2期)2015-12-26 05:03:40
    選擇性應(yīng)用固定物治療浮膝損傷的療效分析
    選擇性執(zhí)法的成因及對(duì)策
    日本三级黄在线观看| 日本一二三区视频观看| 国产高清视频在线播放一区| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久性视频一级片| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 成人三级黄色视频| 精品不卡国产一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 国产单亲对白刺激| 99国产精品一区二区蜜桃av| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久久久久,| 不卡av一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利视频1000在线观看| a级毛片a级免费在线| 亚洲片人在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 成人亚洲精品av一区二区| 国产真实乱freesex| 国产高清有码在线观看视频 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产三级中文精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 91九色精品人成在线观看| 日本三级黄在线观看| 99久久国产精品久久久| 最近最新免费中文字幕在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 九色成人免费人妻av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 波多野结衣高清无吗| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成年免费大片在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| cao死你这个sao货| 18禁国产床啪视频网站| 精品电影一区二区在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产高清视频在线观看网站| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲av片天天在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 嫩草影院精品99| 叶爱在线成人免费视频播放| 岛国在线免费视频观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久香蕉激情| 午夜亚洲福利在线播放| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩国内少妇激情av| 久久久精品大字幕| 成年免费大片在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 97碰自拍视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 极品教师在线免费播放| 亚洲精品在线观看二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产欧美网| 日本三级黄在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美在线一区亚洲| 露出奶头的视频| 免费电影在线观看免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美性长视频在线观看| 久久久精品大字幕| 国产久久久一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 舔av片在线| 深夜精品福利| 色综合亚洲欧美另类图片| 91字幕亚洲| 黄色 视频免费看| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 人人妻人人看人人澡| 婷婷丁香在线五月| 国产成年人精品一区二区| 婷婷亚洲欧美| 伦理电影免费视频| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 极品教师在线免费播放| 免费av毛片视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 我的老师免费观看完整版| 精品福利观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产69精品久久久久777片 | 国产主播在线观看一区二区| 亚洲成人久久性| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美黑人精品巨大| 欧美日本亚洲视频在线播放| 在线观看www视频免费| 亚洲av五月六月丁香网| 不卡av一区二区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久免费精品人妻一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人18禁在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产真实乱freesex| 麻豆国产av国片精品| 丝袜人妻中文字幕| 91av网站免费观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产av不卡久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 宅男免费午夜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 美女免费视频网站| 亚洲真实伦在线观看| 日本黄大片高清| 成年版毛片免费区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 黄片大片在线免费观看| 国产不卡一卡二| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 老司机在亚洲福利影院| 老司机在亚洲福利影院| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一边摸一边做爽爽视频免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 日日夜夜操网爽| 黄色毛片三级朝国网站| 丁香六月欧美| 色综合婷婷激情| 一本综合久久免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 特级一级黄色大片| 亚洲色图av天堂| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 悠悠久久av| 亚洲精品在线美女| 亚洲全国av大片| 国产高清视频在线播放一区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 老司机靠b影院| 少妇粗大呻吟视频| www.自偷自拍.com| 国产三级中文精品| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲自拍偷在线| 日韩欧美精品v在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品国产综合久久久| 中文字幕av在线有码专区| 黑人操中国人逼视频| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲成av人片在线播放无| 老司机深夜福利视频在线观看| 日本熟妇午夜| 婷婷亚洲欧美| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 免费在线观看日本一区| 窝窝影院91人妻| 中文字幕高清在线视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产熟女xx| 激情在线观看视频在线高清| 精品不卡国产一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 日本a在线网址| 日本免费a在线| 91国产中文字幕| 很黄的视频免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久 成人 亚洲| 曰老女人黄片| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产精品999在线| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲av熟女| 中国美女看黄片| 中出人妻视频一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 怎么达到女性高潮| 9191精品国产免费久久| 欧美日韩国产亚洲二区| av免费在线观看网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产真人三级小视频在线观看| www.999成人在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 丝袜人妻中文字幕| 操出白浆在线播放| 一级毛片高清免费大全| 91字幕亚洲| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本五十路高清| 香蕉丝袜av| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产午夜精品论理片| 色在线成人网| 91国产中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 变态另类丝袜制服| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美av亚洲av综合av国产av| xxxwww97欧美| 大型黄色视频在线免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 手机成人av网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久人妻av系列| 国产又色又爽无遮挡免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品 国内视频| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av美国av| 高清在线国产一区| 国产高清激情床上av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| ponron亚洲| 午夜免费激情av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 91字幕亚洲| 国产精华一区二区三区| 黑人操中国人逼视频| www日本黄色视频网| 精品一区二区三区四区五区乱码| 一区二区三区激情视频| 久久精品91无色码中文字幕| 老司机在亚洲福利影院| 69av精品久久久久久| 韩国av一区二区三区四区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 观看免费一级毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久精品91蜜桃| 免费搜索国产男女视频| 欧美乱码精品一区二区三区| videosex国产| 一级毛片精品| 国产黄a三级三级三级人| 级片在线观看| 一进一出好大好爽视频| 热99re8久久精品国产| 国产乱人伦免费视频| 国产午夜精品久久久久久| 99热这里只有精品一区 | 亚洲专区国产一区二区| 老鸭窝网址在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 91av网站免费观看| 在线观看舔阴道视频| 久久香蕉国产精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲精品色激情综合| 亚洲第一电影网av| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲avbb在线观看| av在线播放免费不卡| 两人在一起打扑克的视频| 大型黄色视频在线免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久精品91蜜桃| 久久久久国内视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩欧美免费精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产一区二区三区在线臀色熟女| netflix在线观看网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 免费av毛片视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 午夜福利18| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品在线观看二区| 国产亚洲欧美98| 又粗又爽又猛毛片免费看| 制服诱惑二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费在线观看黄色视频的| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久精品91无色码中文字幕| av福利片在线观看| 亚洲精华国产精华精| 日韩精品中文字幕看吧| 黄频高清免费视频| 香蕉久久夜色| 免费看美女性在线毛片视频| 在线观看舔阴道视频| 亚洲人成77777在线视频| 一级毛片高清免费大全| 舔av片在线| 亚洲午夜理论影院| 我要搜黄色片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久亚洲真实| 国产视频一区二区在线看| 老鸭窝网址在线观看| 成年版毛片免费区| 这个男人来自地球电影免费观看| av福利片在线观看| 黄片大片在线免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 后天国语完整版免费观看| 欧美日韩黄片免| 久久久久九九精品影院| 色哟哟哟哟哟哟| 91国产中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 禁无遮挡网站| 午夜视频精品福利| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲美女黄片视频| 人妻久久中文字幕网| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 午夜激情福利司机影院| 又黄又粗又硬又大视频| 91九色精品人成在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 91av网站免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 在线观看日韩欧美| 老司机在亚洲福利影院| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成年人精品一区二区| 高清在线国产一区| 午夜影院日韩av| 日韩高清综合在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品av视频在线免费观看| 麻豆av在线久日| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 免费在线观看成人毛片| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美日韩乱码在线| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲18禁久久av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜老司机福利片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| svipshipincom国产片| 黑人操中国人逼视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日本一二三区视频观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久这里只有精品中国| 久久这里只有精品19| av免费在线观看网站| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久亚洲av毛片大全| www.www免费av| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久中文看片网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成年免费大片在线观看| 国产三级在线视频| 久久久久性生活片| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜老司机福利片| 男人舔奶头视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| www.www免费av| 欧美乱码精品一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产在线观看jvid| 久久久国产成人精品二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产av不卡久久| 香蕉丝袜av| 国产激情欧美一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 女人被狂操c到高潮| ponron亚洲| a级毛片在线看网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 丰满人妻一区二区三区视频av | 黄片小视频在线播放| 中文在线观看免费www的网站 | 国产激情欧美一区二区| 亚洲18禁久久av| 最近最新中文字幕大全电影3| 色综合亚洲欧美另类图片| 黄色丝袜av网址大全| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲男人的天堂狠狠| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 又爽又黄无遮挡网站| 村上凉子中文字幕在线| 午夜老司机福利片| 日韩免费av在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 日本黄大片高清| 日韩有码中文字幕| 99久久久亚洲精品蜜臀av| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产av一区在线观看免费| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人手机av| 一区二区三区激情视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老汉色∧v一级毛片| www.www免费av| 小说图片视频综合网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 熟女电影av网| 黄片大片在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人午夜高清在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 免费在线观看黄色视频的| 一区二区三区高清视频在线| 日韩大码丰满熟妇| 熟女电影av网| 麻豆国产av国片精品| ponron亚洲| 日本一区二区免费在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99国产精品一区二区蜜桃av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 成在线人永久免费视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看日本一区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲在线自拍视频| АⅤ资源中文在线天堂| 一级毛片高清免费大全| 久久精品综合一区二区三区| netflix在线观看网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久久人人人人人| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 又黄又粗又硬又大视频| 青草久久国产| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 两个人看的免费小视频| 久久中文字幕人妻熟女| 久久国产精品影院| 亚洲人成电影免费在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产激情欧美一区二区| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久久人人人人人| 亚洲avbb在线观看| av有码第一页| 欧美精品亚洲一区二区| av福利片在线| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利在线观看吧| www.自偷自拍.com| 在线播放国产精品三级| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区| 色播亚洲综合网| 精品电影一区二区在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| a级毛片a级免费在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 在线看三级毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 桃红色精品国产亚洲av| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 久久中文字幕一级| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 中出人妻视频一区二区| 天堂√8在线中文| 搞女人的毛片| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久视频播放| 日本五十路高清| 久久人妻av系列| 性色av乱码一区二区三区2| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲最大成人中文| 亚洲人成电影免费在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 成人欧美大片| 精品久久久久久久末码| av中文乱码字幕在线| 九色国产91popny在线| 国产伦人伦偷精品视频| 身体一侧抽搐| 亚洲avbb在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 婷婷精品国产亚洲av| aaaaa片日本免费| 岛国视频午夜一区免费看| 天天一区二区日本电影三级| 在线观看免费午夜福利视频| 99久久精品热视频| 人人妻人人看人人澡| 午夜免费激情av| 村上凉子中文字幕在线| 看免费av毛片| av视频在线观看入口| 久久精品人妻少妇| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美高清成人免费视频www| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一级毛片女人18水好多| 国产精品 国内视频| 国产av在哪里看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲天堂国产精品一区在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国产午夜福利久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲色图av天堂| e午夜精品久久久久久久| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲欧美日韩东京热| 99久久国产精品久久久| 在线免费观看的www视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 99热6这里只有精品| 亚洲精品色激情综合| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久亚洲精品不卡| 韩国av一区二区三区四区| 后天国语完整版免费观看| 久久这里只有精品中国| 国产伦一二天堂av在线观看| av福利片在线| 国产精品一及| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久久性生活片| 天堂√8在线中文| 麻豆成人av在线观看| 中出人妻视频一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美国产日韩亚洲一区|