烤煙根系分泌物降解液對烤煙幼苗根系和光合特性的影響

李 鑫，周冀衡，賓 俊，王 豐

（1.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙410128；2.湖南農業(yè)大學煙草研究院，長沙 410128；3.黔西南州煙草公司，貴州 興義 562400）

烤煙根系分泌物降解液對烤煙幼苗根系和光合特性的影響

李 鑫1，2，周冀衡2，賓 俊1，2，王 豐3*

（1.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙410128；2.湖南農業(yè)大學煙草研究院，長沙 410128；3.黔西南州煙草公司，貴州 興義 562400）

從烤煙根系分泌物中篩選出能夠有效降解煙堿和水楊酸等主要成分的賴氨酸芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌兩種細菌，以5 mL菌液和45 mL分泌物混合施入育苗盤中進行幼苗培養(yǎng)并測定和分析其對烤煙幼苗光合特性、葉綠素熒光特性、葉綠素含量和幼苗根系生長的差異。結果表明，含有降解菌的處理液可提高幼苗生長過程中的光合作用，促進根系生長，同時含寡養(yǎng)單胞菌和賴氨酸芽孢桿菌的處理液對烤煙根系分泌物降解效果最佳，只含有降解水楊酸的寡養(yǎng)單胞菌和賴氨酸芽孢桿菌的降解液處理次之，不含降解菌的處理液對烤煙幼苗生長有抑制作用。盆栽試驗中，兩種菌均能夠降低烤煙根系分泌物對烤煙生長的抑制作用，當兩種菌混合后效果最好。

烤煙根系分泌物；連作障礙；幼苗生長；降解

烤煙是我國重要的經濟作物［1，2］，連作是當前煙草的主要種植模式之一［3］。眾所周知，烤煙連作會導致障礙作用，而造成烤煙連作障礙的一個主要原因是根系向土壤及周邊環(huán)境分泌若干有毒物質，直接抑制和危害烤煙生長，導致植煙土壤中有害真菌群數(shù)量增加，有益細菌、放線菌等微生物的種類和數(shù)量降低［4-6］。嚴重時會出現(xiàn)煙葉長勢、葉生物量、外觀質量和內在品質不同程度的降低。高欣欣等［7］研究認為，烤煙根系分泌物中多種物質可以降低烤煙種子的萌發(fā)；郭亞利等［8］研究認為烤煙連作可以導致烤煙根系對硝酸根離子、磷酸根離子和鉀離子的吸收；田偉等［9］研究認為根系分泌物在抑制煙草生長發(fā)育，增加煙草黑脛病發(fā)病率等方面效應非常明顯。

目前大多數(shù)學者將根系分泌物中的物質分為低分子有機化合物、高分子粘膠物質、細胞或組織脫落物質溶解產物以及質子和無機離子［10］，其中以低分子的有機物質含量最多，諸如苯甲酸、水楊酸、煙堿等［11-15］低分子有機物的影響效果最明顯?，F(xiàn)階段，關于解決烤煙連作障礙的研究主要集中在改良土壤肥力和環(huán)境，如輪間套作［16］、水肥耦合［17］、稻草還田［18］等常規(guī)的農業(yè)措施，而在降解烤煙根系分泌物對連作障礙的響應機制及調控方面研究較少。為此，筆者從烤煙根系分泌物中提取篩選出兩株降解作用效果較好的降解細菌，研究其對烤煙根系分泌物澆灌處理煙苗根系發(fā)育狀況和光合特性的影響，進而為解決連作植煙土壤的大田自毒作用提供理論依據(jù)和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為K326（Nicotiana tobacum L. K326），由貴州省煙草科學研究院提供。降解菌為能夠降解煙堿的賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）和能夠降解水楊酸的寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）。兩種降解細菌均是在前期試驗研究中獲得，其中寡養(yǎng)單胞菌的分離、鑒定已發(fā)表［19］。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解液的制取 兩種降解菌經平板培養(yǎng)后在無菌操作下接種到液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后在4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 烤煙根系分泌物的收集和提取 根系分泌物提取在貴州省煙草科學研究院福泉基地完成，提取時間為2013年7月16日—8月1日。選取長勢良好，未染病，生長一致的K326品種成熟煙株，將其根部洗凈后分別置于裝有20 L去離子水的木桶中培養(yǎng)，每天加去離子水至20 L，用80 W電磁式空氣泵（ACO-003型，上海楚柏實驗室設備有限公司）進行通氧培養(yǎng)，每24小時更換1次煙株，連續(xù)更換10次。將收集的根系分泌物溶液過濾（0.45 μm）后用旋轉蒸發(fā)儀（RE-5205型，上海洪紀儀器設備有限公司）在60 ℃下濃縮10倍，最后在-20 ℃冰箱中冷藏備用。去離子水由試驗用去離子超純水機（東莞市納百川水處理設備有限公司提供）生產。

1.2.3 試驗設計 幼苗生長試驗于2013年8月至2013年10月在貴州省煙草科學研究院人工大棚中進行，采用常規(guī)育苗盤育苗，育苗基質由云南省丘北縣煙用物資有限責任公司提供。8月1日開始播種，育苗15 d后間苗（8月15日），每穴留1株煙苗，每天下午6:00向育苗盤中澆入50 mL相應處理液，連續(xù)灌澆45 d，含有降解菌的處理液在澆入前12 h即在常溫下混勻。采用隨機區(qū)組設計，共設5個澆灌液處理，每個處理3個重復（即3盤幼苗），每個重復12株煙苗。5個處理分別為T1（CK）：普通澆灌水；T2：烤煙根系分泌物；T3：賴氨酸芽孢桿菌和烤煙根系分泌物的混合液；T4：寡養(yǎng)單胞菌和烤煙根系分泌物的混合液；T5：賴氨酸芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌與烤煙根系分泌物的混合液。T3、T4和T5處理的混合液以降解菌液5 mL，分泌物45 mL進行分配。待幼苗生長60 d（10月1日）后測量其光合特性、根系結構和葉綠素熒光等各類指標。

1.3 測定項目與數(shù)據(jù)分析

選取長相一致具有代表性的煙苗根系，采用WinRHIZO植物根系掃描分析系統(tǒng)（北京易科泰生態(tài)技術有限公司）測定幼苗根系結構。采用Li-6400XT便攜式光合作用測定儀和6400-02B紅藍光源（美國Li-cor公司）測定幼苗光合指標。采用M系列IMAGING－PAM（WALZ，德國）調制葉綠素熒光成像系統(tǒng)，選擇煙苗第2～3片葉自上而下進行葉綠素熒光動力學參數(shù)的測定。采用丙酮提取—TU1901紫外分光光度計測定幼苗葉綠素各類指標。

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進行處理，采用SPSS18.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 不同處理對烤煙幼苗根系的影響

從表1看出，各處理間以施入普通澆灌水T1處理的烤煙幼苗根系表現(xiàn)最好，根系生長優(yōu)于其他含有根系分泌物的處理。同時研究分析發(fā)現(xiàn)，含有賴氨酸芽孢桿菌和寡養(yǎng)單胞菌兩種菌的根系分泌物處理T5對幼苗根系的生長優(yōu)于只含有單一降解菌的根系分泌物的T3和T4處理以及無降解菌液的根系分泌物處理T2。說明根系分泌物對烤煙根系生長具有抑制作用，加入降解菌后能夠在一定程度上減輕這種抑制作用，且添加的降解菌種類越多，其抑制作用越弱。

2.2 不同處理對烤煙幼苗葉綠素含量的影響

由表2看出，葉綠素各指標通過不同處理液澆灌后以T1處理為最大，其次是含有兩種降解菌液的根系分泌物處理T5。T5處理與只含有根系分泌物的T2處理間存在差異，且葉綠素a含量差異顯著，其他指標間差異不顯著；含有單一菌液的根系分泌物T3處理和T4處理中的葉綠素各指標均大于處理T2，但差異不顯著?？傮w而言，葉綠素含量以T1＞T5＞T3≈T4＞T2。

2.3 不同處理對烤煙幼苗光合特性的影響

從表3看出，含單一降解菌處理液的T3和T4處理相比T2處理均對烤煙光合特性有一定程度的促進作用，兩處理均比T1處理的光合特性弱，但比只含有根系分泌物的T2處理強。其中，不同處理的葉片凈光合速率T1處理最大，其次是降解菌混合處理液T5處理、寡養(yǎng)單胞菌降解處理液的T4處理和賴氨酸芽孢桿菌降解處理液的T3處理，而只含有根系分泌物的T2處理凈光合速率最低，T1處理與其他處理間均有差異；不同處理液的氣孔導度和蒸騰速率表現(xiàn)趨勢類似，T1處理均比其他處理液高，T2處理最低，T5處理要比T3和T4處理降解效果好；胞間CO2濃度的測定中混合降解菌處理液的T5處理和T3處理以及T4處理不存在顯著差異。

2.4 降解菌對烤煙幼苗葉綠素熒光特性的影響

植物葉綠素熒光信號能快速靈敏地反映植物生理生態(tài)及其與環(huán)境的關系，是一種理想光系統(tǒng)探針［20］，通過熒光參數(shù)分析可直接或間接了解光合機構內部一系列重要的調節(jié)過程，是研究光合代謝的新手段［21］。從表4可以看出，葉綠素熒光特性的各指標在T1處理中為最大，含有根系分泌物的處理均降低了烤煙幼苗的葉綠素熒光特性，只含有根系分泌物的T2處理最小。同時研究發(fā)現(xiàn)，根系分泌物中含有降解菌液的處理能夠有效降低根系分泌物對烤煙幼苗葉綠素熒光特性的抑制，降解菌種類越多，烤煙根系分泌物對幼苗葉綠素熒光特性的抑制程度越弱；分泌物中含有單一的寡養(yǎng)單胞菌的T4處理要比含有單一賴氨酸芽孢桿菌的T3處理抑制作用更弱。

表1 不同處理對烤煙幼苗根系的影響Table1 Effects of different treatments on flue-cured tobacco roots

表2 不同處理對烤煙幼苗葉綠素含量的影響 mg/gTable 2 Effects of different treatments on chlorophyll content of flue-cured tobacco mg/g

表3 不同處理對烤煙幼苗光合特性的影響Table 3 Effects of different treatments on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco

表4 兩種降解菌對烤煙幼苗葉綠素熒光特性的影響Table 4 Effects of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters of flue-cured tobacco

3 討 論

連作障礙是指同一作物或近緣作物連作以后，即使在正常管理情況下，也會產生產量降低、品質變劣、生育狀況變差的現(xiàn)象［22］。連作障礙往往會導致病蟲害加重、土壤次生鹽漬化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破壞等［23］。Asao T等［24］認為導致烤煙連作障礙的一個重要原因是由于本身的自毒作用，由于連年種植，導致烤煙根系會分泌一些自毒物質并積累，達到一定程度會抑制烤煙生長?；形镔|可以對受體植物的細胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反應產生影響［25］。本試驗選取能夠降解煙堿和水楊酸的微生物與烤煙根系分泌物混合定量施加到生長的烤煙幼苗中并測定K326烤煙幼苗光合特性、根系結構、葉綠素熒光特性以及葉綠素含量的變化，反映出烤煙根系分泌物中化感物質對幼苗期烤煙化感作用的生理生化機制和降解菌液的降解效果。

不同種類微生物對烤煙連作障礙降解的程度有所不同，但總體抑制作用占主導。降解菌多以節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）［26］和假單胞菌屬（Pseudomonas）［27］兩類細菌為主，對水楊酸和煙堿有降解作用的微生物目前已有惡臭假單胞菌H2-3（P.putica）［28］、產堿桿菌（Alcaligenes）［29］，煙草節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotianae）［30］和噬煙堿節(jié)桿菌（Arthrobacter niotinovorans）［31］等，它們可以將土壤或溶液中的多種物質分解轉化為羧中的水楊酸。降解菌液可將根系分泌物中的水楊酸和煙堿降解轉化為自身生長所需碳源、氮源和能源，從而達到降解有毒廢物的目的［19，32］。本試驗結果表明，含有降解菌液的處理對烤煙化感作用都有降解效果，寡養(yǎng)單胞菌的降解效果優(yōu)于賴氨酸芽孢桿菌。

本文只研究了兩種降解菌對烤煙幼苗期的化感降解作用，要想有效解決大田烤煙連作土壤的障礙作用，還需研究更多種類和數(shù)量的微生物以及對成熟煙株調制后的煙葉質量和產量影響，其具體降解措施有待進一步研究。

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Effects of Degradation Bacteria Suspension against Flue-cured Tobacco Root Exudates on Root Structure and Photosynthetic Features of Flue-cured Tobacco Seedlings

LI Xin1，2， ZHOU Jiheng2， BIN Jun1，2， WANG Feng3*
（1. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. College of Tobacco Research， Hunan Agricultural University，Changsha 410128， China； 3. Qianxinan Tobacco Company， Xingyi， Guizhou 562400， China）

Two Lysine Bacillus and Stenotrophomonas strains were previously selected from exudates of flue-cured tobacco to be able to depredate effectively nicotine， salicylic acid and other secretions. A mixture of 5ml bacterial suspension and 45 mL secretions was added into the seedling trays to test their effects on flue-cured tobacco seedling photosynthetic characteristics， chlorophyll fluorescence characteristics， chlorophyll content and root growth. The results showed that the exudates containing degrading bacteria could improve photosynthesis during the process of seedling growth， and promote the growth of root. The degradation effect of flue-cured tobacco root exudates containing both Stenotrophomonas Bacillus and Lysine bacteria was the best， followed by the degradation solution that only contained Lysine Bacillus or Stenotrophomonas strains， and that the treating solution without degrading bacteria inhibited the growth of flue-cured tobacco seedlings. In the pot experiment， both bacteria were capable of reducing the inhibition of tobacco growth by root exudates， with the best effect observed when both bacteria were used.

root exudates of flue cured tobacco； continuous cropping obstacles； seedling growth； degradation

S572.04

1007-5119（2015）04-0045-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.04.008

中國煙草總公司貴州省煙草公司項目“烤煙根系分泌物中酚酸及其對煙苗光合特性的影響”（201232）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目“基于烤煙土壤-根系互作機制的煙葉鉀素調控技術研究”（CX2015B238）

李 鑫（1989-），男，在讀博士，研究方向：煙草生物科學與工程技術。E-mail：s2007203272@yeah.net

*通信作者，E-mail：yancaowangfeng@163.com

2014-11-30

2015-06-17