不同復(fù)方中藥提取液止瀉效果的研究

張邑帆，朱買勛，鄭 華，翟少欽，陳春林，張素輝，曹國(guó)文

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌402460）

不同復(fù)方中藥提取液止瀉效果的研究

張邑帆，朱買勛，鄭 華，翟少欽，陳春林，張素輝，曹國(guó)文

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌402460）

為篩選一種高效、安全、經(jīng)濟(jì)的針對(duì)畜禽腹瀉病的復(fù)方中藥，依據(jù)中獸醫(yī)辨證擬定5個(gè)止痢復(fù)方，通過測(cè)定對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌的抑菌作用，篩選效果較好的復(fù)方中藥，再設(shè)高、中、低劑量組，采用灌服番瀉葉的方式導(dǎo)致小鼠腹瀉，以楊樹花口服液作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察復(fù)方對(duì)腹瀉小鼠的止瀉作用；檢測(cè)碳末在小腸內(nèi)推進(jìn)率反應(yīng)藥物對(duì)小腸蠕動(dòng)的影響，小鼠耳廓腫脹度反應(yīng)藥物抑制腫脹效果。結(jié)果顯示，方5的抑菌效果優(yōu)于其他4個(gè)復(fù)方，且效果與藥液濃度成正比。止瀉4 h內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照、高、中劑量組小鼠腹瀉率分別為40%、40%、60%，與空白組（腹瀉率為100%）相比較差異均為極顯著（P＜0.01）；高、中劑量組碳末在腸道內(nèi)的推進(jìn)距離縮短，與空白組相比較差異極顯著（P＜0.01）；中劑量組小鼠耳廓腫脹率降低，與空白組相比較差異顯著（P＜0.05）。表明方5能較好地抑制雞白痢沙門菌和大腸桿菌，改善動(dòng)物小腸蠕動(dòng)，增強(qiáng)抗炎效果。

止瀉；腸推進(jìn)；抗炎

畜禽腹瀉病是嚴(yán)重威脅現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一，畜禽發(fā)生腹瀉性疾病，不僅影響其生長(zhǎng)發(fā)育，還容易引起死亡，嚴(yán)重阻礙我國(guó)畜禽業(yè)的發(fā)展。目前針對(duì)畜禽腹瀉病主要是使用抗生素進(jìn)行防治，但長(zhǎng)期使用或者不合理用藥物不僅導(dǎo)致了耐藥菌株的出現(xiàn)，還致使畜產(chǎn)品的藥物殘留，危害人類健康。中藥活性物不僅具有抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能、提高動(dòng)物抗應(yīng)激和抗炎能力，還富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，且毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，利用中藥防治畜禽疾病已成為近年來研究的熱點(diǎn)［1-3］。本試驗(yàn)依據(jù)中獸醫(yī)辨證理論自擬5個(gè)復(fù)方中藥，通過對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌得抑菌作用篩選效果較好的復(fù)方，并以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，研究該復(fù)方對(duì)番瀉葉所致小鼠腹瀉的止瀉效果及其對(duì)小鼠腸道蠕動(dòng)和抗炎效果，為抗腹瀉中藥的研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明系小鼠150只，體重

26±2 g，雌雄各半，購(gòu)自重慶實(shí)崠生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0003，編號(hào)：0020969。

1.2 試驗(yàn)中藥止痢復(fù)方1：由黃連、秦皮、石榴皮等組成，簡(jiǎn)稱方1；止痢復(fù)方2：由黃連、烏梅、蒼術(shù)等組成，簡(jiǎn)稱方2；止痢復(fù)方3：由黃連、烏梅、辣蓼等組成，簡(jiǎn)稱方3；止痢復(fù)方4：由黃連、木香、秦皮等組成，簡(jiǎn)稱方4；止痢復(fù)方5：由黃連、三顆針、烏梅等組成，簡(jiǎn)稱方5。各復(fù)方藥液濃度均為1 m L含生藥1 g，由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所中獸藥研發(fā)課題組提供。對(duì)照藥物為楊樹花口服液，重慶永健生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20140101。番瀉葉煎劑：將番瀉葉剪碎，浸泡30 min，煎煮5 min，濃縮至1 mL含生藥1 g，滅菌，4℃保存，備用。

1.3 菌株雞白痢沙門菌（Salmonella pullorum），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，菌株編號(hào)CVCC534；大腸桿菌（Escherichia coli），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，菌株編號(hào)CVCC83907。

2 試驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方中藥最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定參照文獻(xiàn)［4］，對(duì)5個(gè)復(fù)方中藥進(jìn)行MIC及MBC的測(cè)定以評(píng)價(jià)其體外抗大腸桿菌和沙門菌的作用效果，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 復(fù)方中藥對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)試驗(yàn)采用牛津杯法，取0.1mL濃度為106～107CFU/mL菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上。每個(gè)平板中放置3個(gè)牛津杯，分別取高、中、低3個(gè)劑量組的藥液200μL，每個(gè)復(fù)方對(duì)每種菌重復(fù)試驗(yàn)3次。分別在培養(yǎng)12 h和24 h時(shí)測(cè)量抑菌圈，判斷藥物敏感性。判定標(biāo)準(zhǔn)：≥20 mm為極敏；15～19mm為高敏；10～14mm為中敏；10 mm以下為低敏［4］。

2.3 復(fù)方中藥對(duì)番瀉葉所致小鼠腹瀉的止瀉作用根據(jù)抑菌試驗(yàn)選擇止瀉效果最佳的復(fù)方，設(shè)高、中、低劑量組，每組小鼠分別按照10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg體重的劑量進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)3 d，灌楊樹花口服液作為陽(yáng)性對(duì)照，灌生理鹽水作為空白對(duì)照。末次給藥30min后按0.4mL/只的劑量灌胃番瀉葉，各鼠單獨(dú)放于鋪有濾紙的鼠籠內(nèi)，每隔1 h更換1次，共觀察6 h，記錄小鼠的總便數(shù)和濕糞數(shù)，統(tǒng)計(jì)2 h、4 h、6 h內(nèi)的腹瀉率和稀便率，重復(fù)試驗(yàn)2次。腹瀉率=腹瀉的動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100%；稀便率=每只動(dòng)物所排的濕糞數(shù)/總便數(shù)。

2.4 復(fù)方中藥對(duì)番瀉葉所致的小鼠小腸推進(jìn)試驗(yàn)選取小鼠50只，同2.3試驗(yàn)進(jìn)行分組和灌藥。末次給藥30 min后分別按0.5 m L/只灌胃碳末阿拉伯膠混懸液，30 min后脫頸處死小鼠，解檢，剪取上自幽門、下至回盲部的腸管，不加牽引地平鋪于平臺(tái)上，觀察記錄各組推進(jìn)情況，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。

2.5 復(fù)方中藥對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)

選取小鼠50只，同2.3試驗(yàn)進(jìn)行分組和灌藥。末次給藥30 min后各組小鼠右耳雙面涂二甲苯0.1mL/只，1h后脫頸處死，剪取小鼠左、右耳片，稱重，計(jì)算小鼠耳廓腫脹率及抑腫脹率。腫脹率=（右耳片重量-左耳片重量）/左耳片重量× 100%；抑制率=（空白組耳片腫脹度-給藥組耳片重量腫脹度）/空白組耳片腫脹度×100%。

2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS18.0軟件LSD法進(jìn)行方差分析，以0.05或0.01作為顯著性差異標(biāo)志。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方中藥對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌的MIC、MBC測(cè)定從表1可知，方5的抑菌、殺菌作用效果較好，對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌的MIC和MBC值均為31.25mg/L。

表1 復(fù)方中藥對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌的MIC、MBC測(cè)定（單位：mg/L）

3.2 復(fù)方中藥對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌體外抑菌效果從表2可知，抑菌12 h后，5個(gè)復(fù)方中藥高劑量組藥物對(duì)大腸桿菌和雞白痢沙門菌極敏；中劑量時(shí)，方1對(duì)大腸桿菌失去了抑菌效果，只有方3、方5對(duì)其仍處于極敏，與其他組相比較差異極顯著（P＜0.01）；抑菌24 h后，只有方5的高、中、低劑量組能同時(shí)對(duì)大腸桿菌和雞白痢沙門菌有抑菌效果，因此方5為抑菌效果較好的復(fù)方中藥。

3.3 方5對(duì)番瀉葉所致的小鼠腹瀉的作用從表3可知，在2 h內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照、高劑量組腹瀉率降為0，中劑量組降為20%，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腹瀉率逐漸升高；稀便率也隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，陽(yáng)性對(duì)照、高、中劑量組的稀便率與其對(duì)應(yīng)時(shí)間段空白組的稀便率相比較差異極顯著（P＜0.01），而低劑量組與空白組相比較差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同復(fù)方中藥對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌體外抑菌效果（單位：mm）

表3 方5對(duì)番瀉葉致瀉小鼠腹瀉的影響（n=10）

3.4 方5對(duì)番瀉葉所致的小鼠小腸推進(jìn)試驗(yàn)從表4可知，陽(yáng)性對(duì)照、方5高、中劑量組能顯著減慢小腸推進(jìn)速度，縮短碳末在腸道內(nèi)的推進(jìn)距離，與空白組比較，差異極顯著（P＜0.01）。

表4 方5對(duì)小鼠小腸推進(jìn)的影響（n=10）

3.5 方5對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)從表5可知，高、低劑量抑制耳廓腫脹效果不明顯，陽(yáng)性對(duì)照、中劑量組能顯著抑制耳廓腫脹，與空白組比較，差異顯著（P＜0.05）。

組別劑量（g/kg）腫脹率/%抑腫率/%

表5 方5對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（n=10）

4 討論

試驗(yàn)采用番瀉葉復(fù)制小鼠腹瀉模型，其致瀉作用主要是其有效成分蒽醌類能刺激小鼠腸合成并釋放前列腺素（PG），促進(jìn)結(jié)腸的水和電解質(zhì)凈分泌，刺激主動(dòng)Cl-分泌，加速大腸內(nèi)容物輸送及瀉下作用［5］。試驗(yàn)小鼠灌服番瀉葉后，出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉現(xiàn)象，證明了番瀉葉致小鼠腹瀉模型建立成功。

依據(jù)現(xiàn)代藥理研究，中藥黃連和三顆針富含小檗堿、黃連素，烏梅有多種揮發(fā)性物質(zhì)、有機(jī)酸和黃酮類物質(zhì)，在體外對(duì)沙門菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌以及臨床分離的多種腸球菌有抑殺作用；烏梅、秦皮、石榴皮具有澀腸止痢的功效；蒼術(shù)、木香能調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)，降低小腸緊張性和節(jié)律性收縮，還有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用［6-7］。試驗(yàn)按照中獸醫(yī)辨證擬定的5個(gè)復(fù)方中藥，都有抑菌和調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的功效，結(jié)果顯示方5效果較好，分析其原因可能是方5中黃連和三顆針含有小檗堿和黃連素，能加大對(duì)細(xì)菌的抑殺作用，同時(shí)輔以烏梅，其富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滋養(yǎng)動(dòng)物機(jī)體，提高免疫功能，增強(qiáng)止痢效果。

動(dòng)物機(jī)體在長(zhǎng)期的瀉痢之后，胃腸道將會(huì)并發(fā)炎癥，在治療動(dòng)物腹瀉的同時(shí)需要改善胃腸道功能，降低胃腸蠕動(dòng)能力，進(jìn)行消炎處理。炎癥是機(jī)體組織對(duì)各種致炎因子引起損傷所發(fā)生的防御反應(yīng)，炎癥過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞自身的損傷引起組織液和部分血液外滲等而致瀉，發(fā)生的越嚴(yán)重，腹瀉也越嚴(yán)重，說明止瀉與抗炎是密不可分的，要得到較好的止瀉效果必須進(jìn)行抗炎［8-9］。試驗(yàn)中方5組中的小鼠在灌服中藥后能顯著抑制小鼠耳廓腫脹，說明該藥有一定的抗炎作用；且小腸內(nèi)碳末推進(jìn)距離縮短，能有效地減慢小腸的蠕動(dòng)能力，證實(shí)該藥有較好的止瀉效果。

5 結(jié)論

5個(gè)復(fù)方中藥體外對(duì)雞白痢沙門菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用，其中方5效果較好，且能改善番瀉葉所致小腹瀉鼠改善小腸蠕動(dòng)，增強(qiáng)抗炎效果。

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S865.1+3

B

0529-6005（2015）12-0062-03

2015-06-16

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303040-06）

張邑帆（1982-），男，獸醫(yī)師，碩士，從事中獸藥藥理毒理學(xué)研究，E-mail：zmxmz0817@163.com

曹國(guó)文，E-mail：caoguowen1957@126.com