應(yīng)用病毒計(jì)數(shù)儀定量檢測(cè)雞傳染性支氣管炎抗原方法的建立

楊小蓉，李浩鵬，張秀美，袁 野，姬書玲

（1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京豐臺(tái)100070；2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，河南鄭州450061）

應(yīng)用病毒計(jì)數(shù)儀定量檢測(cè)雞傳染性支氣管炎抗原方法的建立

楊小蓉1，李浩鵬2，張秀美2，袁 野2，姬書玲2

（1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京豐臺(tái)100070；2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，河南鄭州450061）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疫病之一，疫苗質(zhì)量的提升對(duì)于該疫病的防控有著至關(guān)重要的意義。目前國(guó)內(nèi)對(duì)IB疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制主要有雞胚半數(shù)感染量（EID50）和動(dòng)物試驗(yàn)，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、試驗(yàn)受干擾因素多。本研究采用病毒計(jì)數(shù)儀對(duì)IB病毒粒子進(jìn)行定量檢測(cè)，同時(shí)與EID50檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，本研究方法檢測(cè)時(shí)間只需10min，有耗時(shí)短、準(zhǔn)確性較高、受干擾因素少的特點(diǎn)，對(duì)IB疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制提供了較好的方法。

雞傳染性支氣管炎；病毒計(jì)數(shù)儀；定量檢測(cè)

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis Virus）引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病，臨床以呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋雞群產(chǎn)蛋率和品質(zhì)下降、腎病變?yōu)橹饕卣?，發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-3］。IBV血清型眾多、不同血清型之間的交叉保護(hù)性較差的特點(diǎn)，更增加了防控的難度［3-4］。因此，提高疫苗質(zhì)量，對(duì)于防治IB疫病發(fā)生和流行具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)IB疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制主要有EID50和動(dòng)物試驗(yàn)，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、試驗(yàn)受干擾因素多。本研究采用病毒計(jì)數(shù)儀，只需10min，即可對(duì)IB病毒粒子進(jìn)行定量檢測(cè)，耗時(shí)短、準(zhǔn)確性較高、受干擾因素少，對(duì)IB疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制提供了較好的方法。

1 材料與方法

1.1 IB抗原由本實(shí)驗(yàn)室保存；雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；ViroCyt病毒計(jì)數(shù)儀和病毒計(jì)數(shù)染色試劑盒（Virus Counter Reagent Kit），均購(gòu)自艾貝泰公司。

1.2 病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)

1.2.1 病毒樣品染色（1）將收集的病毒樣品在室溫下用14 000 r/min離心10min，收集病毒上清用于計(jì)數(shù)檢測(cè)；（2）將20μL的病毒上清液加入到180μL的Sample Dilution Buffer中；（3）將Combo Dye工作液混勻，加100μL到200μL上述樣品管中；（4）將樣品管蓋子蓋上，徹底震蕩混勻；（5）室溫放置30min，避光染色；染色完的樣品在等待檢測(cè)過(guò)程中，保持避光。

1.2.2 病毒樣品檢測(cè)（1）打開(kāi)病毒計(jì)數(shù)儀，進(jìn)行自動(dòng)清洗。依次完成ISW液體管、CVF液體管檢驗(yàn)，待顯示“passed”后，換上PVS液體管；選擇“PVS”按鈕并顯示“successful”后，即可進(jìn)行病毒樣品的檢測(cè)；（2）再依次ISW液體管、CVF液體管檢驗(yàn)并顯示“passed”后，裝上待檢病毒樣品，選擇“Start Analysis”按鈕，開(kāi)始分析樣品，并顯示“col?lecting Data”。

待檢測(cè)完成后，保存數(shù)據(jù)，卸下樣品管。再依次ISW液體管、CVF液體管檢驗(yàn)并顯示“passed”后，即可檢測(cè)第2個(gè)樣品。直至病毒檢測(cè)完后，清洗管道并關(guān)機(jī)。

1.3 病毒半數(shù)感染量檢測(cè)將病毒懸液作10倍系列稀釋，取適宜稀釋度，以0.1 mL劑量接種雞胚。由最高稀釋度開(kāi)始接種，每個(gè)稀釋度接種6枚，觀察并記錄雞胚的病變情況；按中國(guó)獸藥典（2010年版）計(jì)算半數(shù)感染量（EID50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)果對(duì)IB病毒抗原每個(gè)濃度梯度的檢測(cè)均重復(fù)3次，活病毒原倍和活病毒5倍的檢測(cè)結(jié)果平均值分別是6.37×108VP/m L和3.3×109VP/mL，呈5倍線性關(guān)系。5倍抗原經(jīng)過(guò)滅活前后的平均濃度分別是3.3×109VP/mL和5.77×108VP/mL。

滅活病毒抗原分別濃縮至5、10、20倍，其檢測(cè)平均濃度分別為5.77×108VP/mL、1.1×109VP/ mL、1.9×109VP/mL，呈線性關(guān)系。每個(gè)濃度梯度分別重復(fù)檢測(cè)3次，其變異系數(shù)范圍為3.95%～9.09%，說(shuō)明該方法成立。

2.2 病毒半數(shù)感染量檢測(cè)結(jié)果IB抗原活病毒原倍、5倍抗原檢測(cè)結(jié)果分別是106.63/0.1mL、106.83/ 0.1 mL，即4.3×107EID50/m L、6.76×107EID50/mL。

3 討論

EID50是在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，通過(guò)指定感染途徑，使雞胚半數(shù)感染所需的最小抗原量。EID50檢測(cè)的是具有感染性的活病毒的數(shù)量，并不體現(xiàn)病毒的總濃度（總顆粒數(shù)），同時(shí)判定雞胚感染具有主觀性。病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)的濃度是所有完整病毒粒子的個(gè)數(shù)，包括所有具有完整結(jié)構(gòu)的活病毒和滅活病毒，其檢測(cè)結(jié)果客觀。因此，活病毒抗原原倍和5倍樣品的EID50值分別為4.3×107EID50/m L和6.76×107EID50/mL，病毒計(jì)數(shù)檢測(cè)濃度則分別為6.37×108VP/mL和3.3×109VP/mL是合理的。5倍抗原經(jīng)過(guò)滅活前后的平均濃度分別是3.3×109VP/ mL和5.77×108VP/mL，說(shuō)明滅活對(duì)病毒完整性有一定損失，符合生產(chǎn)實(shí)際情況。用病毒計(jì)數(shù)儀分別對(duì)每個(gè)抗原濃度梯度重復(fù)檢測(cè)3次，其變異系數(shù)范圍均小于10%，說(shuō)明該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。

表1 病毒計(jì)數(shù)儀和病毒半數(shù)感染量檢測(cè)

非感染性病毒的數(shù)量在總病毒數(shù)量中占有一定比例，能影響體內(nèi)和體外的研究結(jié)果。所以快速測(cè)定病毒總濃度的方法是非常必要的。在動(dòng)物疫病的預(yù)防和治療中，采用感染性的方法測(cè)得病毒滴度來(lái)決定注射的劑量，往往忽視了非感染性的病毒顆粒在動(dòng)物免疫中的作用和最終疫苗的效果。比如EID50測(cè)得病毒濃度為6.76×107EID50/mL，但是病毒總濃度是3.3×109VP/mL，在每一個(gè)感染顆粒中，大約有50個(gè)顆粒沒(méi)有被計(jì)數(shù)，最終可能影響動(dòng)物免疫結(jié)果。

鑒于非感染性病毒顆粒的生物學(xué)作用和在疫苗生產(chǎn)中的作用，感染性病毒顆粒和總病毒顆粒的定量檢測(cè)對(duì)于病毒疫苗的生產(chǎn)和研究均十分重要［5-7］，而病毒計(jì)數(shù)儀在10min內(nèi)就能快速檢測(cè)到病毒的總濃度，該方法優(yōu)勢(shì)明顯。病毒計(jì)數(shù)儀定量檢測(cè)IB病毒抗原耗時(shí)短、準(zhǔn)確性較高、受干擾因素少，廣泛應(yīng)用于病毒的研究和生產(chǎn)中將發(fā)揮重大作用，也對(duì)IB疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量控制提供了較好的方法。

［1］Promkuntod N，Thongmee S，Yoidam S.Analysis of the S1 gene of the avian infectious bronchitis virus（IBV）reveals changes in the IBV genetic groups circulating in southern Thailand［J］.Res Vet Sci，2015，100：299-302.

［2］安健，田麗英，李煥榮.雞傳染性支氣管炎病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001，37（9）：30-33.

［3］劉勝旺.我國(guó)雞傳染性支氣管炎流行現(xiàn)狀及原因分析［J］.中國(guó)家禽，2010，32（16）：5-9.

［4］潘盛，王紅寧，周生，等.雞傳染性支氣管炎病毒遺傳變異研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（8）：8-12.

［5］粟碩，張桂紅.雞傳染性支氣管炎診斷方法研究進(jìn)展及應(yīng)用概況［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：77-80.

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［7］王文秀，顧節(jié)清，沈志強(qiáng).雞傳染性支氣管炎病毒變異機(jī)理及疫苗研究現(xiàn)狀［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（12）：116-119.

Establish themethod of quantitative detection of IBV antigen by Virus Counter

YANG Xiao-rong1，LIHao-peng2，ZHANG Xiu-mei2，YUAN Ye2，JIShu-ling2
（1.China Animal Husbandry Industry Co.Ltd，Beijing 100070，China；2.Zhengzhou Pharmaceutical Factory，Qian Yuan Hao Biological Co.Ltd，Zhengzhou 450061，China）

Infectious bronchitis（IB）is one of themajor disease in poultry industry，and the quality of the vaccine is very im?portant to preventand control the disease.At present，quality control of IB vaccinemainly uses egg infectious dose（EID50）and ani?mal experiments.Thesemethods are complex，time-consuming，and subject to interference bymany factors.Compared with EID50，method to detect virus particles just needs 10minutes，which is less time consuming，has higher accuracy，and is less affected by disturbances salient features.We hope to provide better quantitative detectingmethod for IB vaccine.

Infectious Bronchitis；Virus Counter；quantitative detection

S852.65+9.5

A

0529-6005（2015）12-0039-02

2015-07-07

楊小蓉（1985-），女，碩士，從事生物制品研究，E-mail：yxr3816@163.com