西方角蠅和截脈角蠅18S rDNA的克隆及其分子系統(tǒng)學(xué)研究

史紅蕾，鄧 僑，楊蓮茹，楊曉野，王 瑞，鄭文青，楊 波

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

西方角蠅和截脈角蠅18S rDNA的克隆及其分子系統(tǒng)學(xué)研究

史紅蕾，鄧 僑，楊蓮茹，楊曉野，王 瑞，鄭文青，楊 波

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

為了弄清雙翅目昆蟲西方角蠅（Haematobia.irritans）和截脈角蠅（Haematobia.titillans）18S rDNA基因序列及其分子進化。本研究測定了兩種角蠅的18S rDNA基因序列，將其在NCBI中Blast，并將序列與GenBank中已知9種雙翅目昆蟲的18S rDNA基因序列進行比較分析，找出它們的同源區(qū)和多變區(qū)，利用全序列和最保守同源區(qū)分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，西方角蠅和截脈角蠅18S rDNA基因序列長度均為1 984 bp，二者同源性為96.4%，存在73個識別位點。兩種角蠅與GenBank中已登陸西方角蠅的同源性分別為99.1%和95.7%。11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列中均有三段保守程度較高的同源區(qū)，分別相當于西方角蠅18S rDNA基因序列中320 bp～693 bp，848 bp～1 181 bp和1 606 bp～1 849 bp，其中第一段同源區(qū)最為保守。本文在國內(nèi)外首次報道截脈角蠅18S rDNA基因序列，并證明了西方角蠅18S rDNA基因序列高度保守。利用18S rDNA基因序列中最保守同源區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，對11種雙翅目昆蟲分類更符合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。

西方角蠅；截脈角蠅；18S rDNA；序列分析

西方角蠅（Haematobia irritans）和截脈角蠅（Haematobia titillans）是內(nèi)蒙古地區(qū)荒漠化草原危害較嚴重的吸血蠅。它們寄生于駱駝、牛、羊等反芻家畜的體表，以吸血為生，不僅會對家畜造成機械性損傷，還會使其產(chǎn)生強烈應(yīng)激反應(yīng)，甚至引起某些蟲媒性疾?。?］。趙治國等（2010）研究表明，西方角蠅和截脈角蠅是駱駝斯氏副柔線蟲病的傳播媒介［2］，而駱駝斯氏副柔線蟲病是嚴重危害養(yǎng)駝業(yè)的一種寄生蟲病。

18S rDNA是指由染色體編碼的真核生物核糖體小亞基RNA，是至今發(fā)現(xiàn)的DNA序列中最保守的一類［3］。目前，已有許多學(xué)者研究昆蟲的18S rDNA基因序列，如魏國清等（2006）對鱗翅目昆蟲家蠶18S rDNA基因序列的特點及分子系統(tǒng)學(xué)進行了研究［4］；李海超等（2009）分析了鱗翅目煙夜蛾18S rDNA基因序列［5］；王海亭等（2010）克隆了玉米螟的18S rDNA基因序列并做了分子系統(tǒng)學(xué)研究［6］。目前，許多生物的18S rDNA基因序列已發(fā)表或輸入DNA數(shù)據(jù)庫［7-8］，為昆蟲18S rDNA分子系統(tǒng)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究測定了內(nèi)蒙古地區(qū)西方角蠅和截脈角蠅18S rDNA基因序列，將其在NCBI中Blast，確定兩種角蠅的18S rDNA基因序列是否保守，以獲得可用于區(qū)分兩種角蠅的易變區(qū)及差異位點；并與GenBank中已知18S rDNA基因序列的9種雙翅目昆蟲進行比較分析，找出它們的同源區(qū)，利用18S rDNA基因序列及其最保守同源區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定兩種角蠅在雙翅目昆蟲中的位置，為雙翅目昆蟲之間的差異性及其分子系統(tǒng)進化特點研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蠅種來源及基因組DNA提取西方角蠅和截脈角蠅采自內(nèi)蒙古地區(qū)荒漠化草原駱駝生活環(huán)境中，分別取其單只胸部肌肉10mg提取基因組DNA。

1.2 引物及PCR反應(yīng)以王瑛（1999）設(shè)計的昆蟲18S rDNA基因通用引物［9］，對角蠅基因組DNA進行PCR擴增，1、2和3、4兩對引物序列如下:

1：5′-TACCCTGGTGTGATCCTGCCAGT-3′；2：5′-ACTAGGGCGGTATCTGATCGC-3′；3：5′-GCGATCAGATACCGCCCTAGT-3′；4：5′-GATCCTTCCT?GCAGGTTCACCT-3′。

PCR擴增片段長度為1 086 bp和835 bp。兩對引物PCR反應(yīng)體系均為50μL。反應(yīng)條件均為94℃預(yù)變性10 min，進入循環(huán)；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.3 PCR產(chǎn)物的克隆與測序?qū)CR膠回收產(chǎn)物與pMD19-TVector連接，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，在轉(zhuǎn)化平板上37℃培養(yǎng)12 h，待藍白斑清晰時，挑選白斑轉(zhuǎn)入含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中擴繁，用PCR方法鑒定陽性克隆菌液后測序。

1.4 序列的分析比較利用EditSeq程序?qū)煞N角蠅的測序結(jié)果進行拼接，獲得其18S rDNA基因序列。另在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取9種雙翅目昆蟲的18S rDNA基因序列。利用MegAlign程序處理11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列進行排序處理，找出它們的同源區(qū)和多變區(qū)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果西方角蠅和截脈角蠅18S rDNA基因序列長度均為1 984 bp，分別與GenBank中已登錄的西方角蠅18S rDNA基因序列（EU179518.1）同源性為99.1%和95.7%，其中截脈角蠅的18S rDNA基因序列尚未在GenBank中登錄。

2.2 同源性比較與序列分析結(jié)果11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列同源性比較結(jié)果見圖1，其同源性范圍為93.2%～99.3%。通過序列分析可知，11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因具有三段保守程度較高的同源區(qū)，分別相當于西方角蠅18S rDNA的320～693 bp、848～1 181 bp、1 569～1 849 bp，其中第一段同源區(qū)最為保守。11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因的各堿基含量相近，其A+T含量均高于G+C含量。兩種角蠅18S rDNA基因序列之間共有73個識別位點，堿基差異為A與T間的替換。

圖1 11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列的同源性與差異性比較

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果由11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列和最保守同源區(qū)分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可見（圖2、圖3），兩個系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)不一致，雖然都分兩個大集落，但結(jié)點和進化分支不同。

3 討論與小結(jié)

本研究測定的西方角蠅18S rDNA基因序列與GenBank中已登錄的西方角蠅18S rDNA基因序列差異性僅為0.9%，表明西方角蠅18S rDNA基因序列高度保守；而截脈角蠅18S rDNA基因序列屬國內(nèi)外首次報道。選取已知18S rDNA基因序列的9種雙翅目昆蟲，通過比較它們與兩種角蠅18S rDNA基因序列的同源性，可知11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列均具有3段保守程度較高的同源區(qū)。

上述11種雙翅目昆蟲分屬6科，即蠅科（Mus?cidae）、花蠅科（Anthomyiidae）、果蠅科（Drosophili?dae）、實蠅科（Tephritidae）、寄蠅科（Tachinidae）和舌蠅科（Glossinoidae）。據(jù)中國動物志［10］等資料可知，此六科昆蟲均隸屬于昆蟲綱（Insecta）、雙翅目（Diptera）、環(huán)裂亞目（Cyclorrhapha）、蠅形支目（Muscomorpha）。蠅形支目昆蟲又分為有瓣類和無瓣類，其中蠅科、花蠅科、寄蠅科和舌蠅科屬于有瓣類，果蠅科和實蠅科屬于無瓣類。本研究以11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列和最保守同源區(qū)分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過比較發(fā)現(xiàn)，由最保守同源區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)反映的種系關(guān)系更符合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)蠅形支目的物種分類基本一致，即有瓣類聚為一類，無瓣類聚為一類。在有瓣昆蟲類群中，角蠅屬的西方角蠅和截脈角蠅先聚在一起，再與其同科中的家蠅共聚在一支上；而寄蠅科的兩種寄蠅、花蠅科的甘藍地種蠅和舌蠅科的蛟舌蠅依次與西方角蠅、截脈角蠅和家蠅聚在一起。在無瓣昆蟲類群中，地中海實蠅與墨西哥按實蠅聚在一起，果蠅與擬果蠅聚在一起，而后兩者聚為一類。綜上所述，18S rDNA基因序列中最保守同源區(qū)適用于研究不同雙翅目昆蟲物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

圖2 11種雙翅目昆蟲18S rDNA全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 11種雙翅目昆蟲18S rDNA最保守同源區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

核酸序列中堿基組成偏異會對系統(tǒng)發(fā)育樹的重建產(chǎn)生一定的影響［11］，本研究中11種雙翅目昆蟲18S rDNA基因序列的4種堿基含量基本相似，組成上無偏異，均表現(xiàn)出A+T含量高于G+C含量。故本研究以18S rDNA基因序列最保守同源區(qū)為靶分子重建系統(tǒng)發(fā)育樹未受堿基組成偏異的影響，可較為真實地在分子水平上反映雙翅目各科昆蟲的進化情況。

［1］Lorena T，Consuelo A，Nieves A，et al.Identification ofmicroor?ganisms in partially fed female horn flies，Haematobia irritans［J］. Parasitol Res，2012，111（3）：1391-1395.

［2］趙治國.我國駱駝斯氏副柔線蟲病傳播媒介的研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2010.

［3］劉誠剛，杜智恒，白秀娟.野生烏蘇里貉18S rDNA全序列的克隆測序及系統(tǒng)進化樹分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012（2）：117-118.

［4］魏國清，代君君，劉朝良，等.家蠶核糖體18SRNA基因的序列分析及分子系統(tǒng)學(xué)研究［J］.經(jīng)濟動物學(xué)報，2006，10（3）：151-155.

［5］李海超，喬奇，原國輝，等.煙夜蛾18S rDNA的克隆及序列分析［J］.動物分類學(xué)報，2009，34（4）：816-822.

［6］王海亭，賈月麗，程曉東，等.亞洲玉米螟核糖體18S rRNA基因的序列分析及分子系統(tǒng)學(xué)研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，44（2）：85-190.

［7］Neeb J，Van de peer Y，Hendricks L，et al.Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences［J］.Nucleic Acids Res，1990，18（Suppl）：2237-2317.

［8］Kjer K M.Aligned 18S and insect phylogeny［J］.Syst Biol，2004，53（3）：506-514.

［9］王瑛，陳曉峰，劉偉，等.棉鈴蟲18S核糖體RNA基因的序列分析及其分子系統(tǒng)學(xué)［J］.昆蟲學(xué)報，1999，42（3）：241-247.

［10］范滋德.中國動物志昆蟲綱（第四十九卷，雙翅目：蠅科）［M］.北京：科學(xué)出版社，2008.

［11］Lockhart pJ，Howe C J，Bryant D A，et al.Substitutional bias confounds inference of cyanelle origins from sequence data［J］.J Mol Evol，1992，34（2）：153-162.

The 18S rDNA cloning andmolecular systematics study of Haematobia irritans and H.titillans

SHIHong-lei，DENGQiao，YANG Lian-ru，YANG Xiao-ye，WANGRui，ZHENGWen-qing，YANG Bo
（College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University；Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease，Ministry of Agriculture，Hohhot 010018，China）

In order to get 18S rDNA sequence and molecular evolution of diptera insects Haematobia irritans and H.titillans，we sequenced the 18S rDNA of horn flies.Then the sequence was blasted in the NCBI，and compared with the 18S rDNA of the other nine insects of Diptera in GenBank to find out their homologous regions and variable regions.Phylogenetic treewas construct?ed by using the complete sequence and themost conserved homologous regions.The results indicated that the 18S rDNA sequence length of Haematobia irritans and H.titillans was 1 984 bp.The homology between them was 96.4%and there were 73 recognition sites.The homology of the two horn flies with the H.irritans reported in GenBank was 99.1%and 95.7%respectively.There were three highly conserved homologous regions in the 18S rDNA gene sequences of 11 kinds of diptera insects，which was equivalent to the sequence from 320 bpto 693 bp，848 bpto 1 181 bpand 1 606 bpto 1 849 bpin 18S rDNA gene sequences of Haematobia ir?ritans respectively，while the first section of the homologous regionswas themost conservative.The 18S rDNA gene sequences of H.titillans were reported for the first time in the world in this article，and it proved the 18S rDNA gene sequence of H.irritans was highly conserved.So itmaybemore scientific to classify the 11 kinds of diptera insects by the phylogenetic tree，which was con?structed by using the most conservative homologous region，than the one constructed by the whole sequence，itwas in accordance with the resultof the traditionalmorphological classification.

Haematobia irritans；Haematobia titillans；18S rDNA；Sequence Analysis

s：YANG Lian-ru；YANG Xiao-ye

S852.74+3

A

0529-6005（2015）12-0036-03

2015-03-02

國家自然科學(xué)基金（31160502）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303037）

史紅蕾（1988-），女，碩士生，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究，E-mail：14747345688@163.com

楊蓮茹，E-mail：lianruyang122@163.com；楊曉野，E-mail：xiaoyeyang122@sohu.com