偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品制備及其應(yīng)用

喬彩霞，尹 羿，蒲 靜，高志強(qiáng)，汪 琳，任 彤，張 偉，張利峰，張鶴曉

偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品制備及其應(yīng)用

喬彩霞，尹 羿，蒲 靜，高志強(qiáng)，汪 琳，任 彤，張 偉，張利峰，張鶴曉

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京朝陽(yáng)100026）

能力驗(yàn)證樣品的制備是實(shí)驗(yàn)室病原核酸檢測(cè)能力驗(yàn)證的難點(diǎn)和核心內(nèi)容，本研究以偽狂犬病病毒南陽(yáng)株細(xì)胞培養(yǎng)物為材料，通過高溫處理的方式滅活病毒，研制了偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)的能力驗(yàn)證樣品，經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)證實(shí)樣品達(dá)到中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)對(duì)能力驗(yàn)證樣品的要求。利用能力驗(yàn)證樣品，設(shè)計(jì)和實(shí)施了“BIQTC-2013-01《豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)》能力驗(yàn)證計(jì)劃”，共有7家實(shí)驗(yàn)室參試，驗(yàn)證滿意率達(dá)100%。偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品的研制和在能力驗(yàn)證計(jì)劃中的應(yīng)用，為評(píng)估我國(guó)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)的能力提供了較有價(jià)值的借鑒和參考。

偽狂犬病病毒；核酸檢測(cè)；能力驗(yàn)證

偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PrV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬的豬皰疹病毒I型，能引起豬、牛、羊、犬等多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)病，其中對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最大。豬感染后主要表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙和仔豬的高病死率，病死豬是PRV的貯存宿主和傳染源。偽狂犬病呈全球性分布，通過實(shí)施根除計(jì)劃，美國(guó)、荷蘭等國(guó)家已經(jīng)撲滅了該病。但在我國(guó)和世界許多國(guó)家，本病仍頻繁發(fā)生，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且直接影響生豬及其產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易，成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要因素［1-2］。

核酸檢測(cè)技術(shù)因具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在偽狂犬病病毒的病原學(xué)檢測(cè)和臨床診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研制了多種偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)技術(shù)，其中應(yīng)用最多的是普通PCR和熒光PCR技術(shù)［3-4］。這些檢測(cè)技術(shù)的商品化試劑盒也呈現(xiàn)出復(fù)雜多樣的趨勢(shì)，加之我國(guó)各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室條件、技術(shù)水平差異較大，對(duì)偽狂犬病毒核酸檢測(cè)等能力差異較大。同時(shí)，對(duì)于病病毒的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，包括了樣品制備、核酸提取、PCR和結(jié)果分析等眾多環(huán)節(jié)，每一環(huán)節(jié)的不當(dāng)均會(huì)直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。正確、可靠的核酸檢測(cè)結(jié)果有賴于使用統(tǒng)一的質(zhì)控樣品對(duì)檢測(cè)方法和試劑進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。因此一種理想的病毒核酸質(zhì)控樣品也是試劑溯源、測(cè)量程序評(píng)價(jià)和不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果比較的基本條件。

為了合理評(píng)估各級(jí)實(shí)驗(yàn)室偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)的技術(shù)水平和能力，我們?cè)谘兄苽慰袢〔《竞怂釞z測(cè)能力驗(yàn)證樣品的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和實(shí)施了“BIQTC-2013-01《豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)》能力驗(yàn)證計(jì)劃”，為今后偽狂犬病核酸檢測(cè)能力的評(píng)估驗(yàn)證提供了有價(jià)值的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞偽狂犬病病毒南陽(yáng)株（Namy?angjuGQ325658.1）和PK15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2主要試劑MEM細(xì)胞培養(yǎng)、胎牛血清，購(gòu)自Gibco公司；DNAZol、Taq DNA酶、dNTP等PCR擴(kuò)增試劑，購(gòu)自Promega公司。

1.3 主要檢測(cè)方法及引物、探針應(yīng)用的檢測(cè)方法有偽狂犬病病毒熒光PCR，由本實(shí)驗(yàn)室建立［4］，普通PCR，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《偽狂犬病診斷方法》（GB/T 18641-2002）操作。引物、探針詳細(xì)序列信息見表1。

表1 能力驗(yàn)證樣品制備所用檢測(cè)方法及引物和探針

1.4 能力驗(yàn)證樣品的制備

1.4.1 陽(yáng)性質(zhì)控樣品將已長(zhǎng)成單層的PK15細(xì)胞棄去生長(zhǎng)液，按1%（V/V）接種PRV南陽(yáng)株毒種，37℃吸附1 h，加入含2%牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置37℃下培養(yǎng)觀察3～5 d，當(dāng)75%～95%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲，置-70℃下凍融3次，1 000 r/min離心10min，取上清液置于56℃水浴箱加熱滅活30 min，-70℃保存?zhèn)溆?。病毒培養(yǎng)液的滅活檢驗(yàn)，選用PK15細(xì)胞，接種上述樣品，觀察3～5 d，應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變出現(xiàn)。樣品的稀釋，用PBS（0.01mol/L，pH值7.2）將PRV病毒培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，采用熒光PCR和普通PCR分別檢測(cè)，選取熒光PCR的Ct值在18～22之間，普通PCR出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶的稀釋倍數(shù)，作為最終稀釋倍數(shù)，將培養(yǎng)液充分稀釋混勻后，每管分裝500μL，作為PRV核酸檢測(cè)能力驗(yàn)證的陽(yáng)性樣品。1.4.2陰性質(zhì)控樣品不含PRV的PBS（0.01mol/ L，pH值7.2）溶液，每管分裝500μL，作為PRV核酸檢測(cè)能力驗(yàn)證的陰性樣品。

1.5 能力驗(yàn)證樣品的分析

1.5.1 均勻性檢驗(yàn)為保證驗(yàn)證樣品的均勻分布，隨機(jī)從-20℃保存的能力驗(yàn)證樣品中各抽取10支，編號(hào)后提取DNA，采用偽狂犬病病毒熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)為一次操作，一次上機(jī)完成。對(duì)檢測(cè)獲得的Ct值，采用單因子方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析其變異系數(shù)。

1.5.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)作為能力驗(yàn)證樣品需通過快遞方式向參試實(shí)驗(yàn)室發(fā)放樣品，為了確保樣品的穩(wěn)定性，我們模擬了樣品的實(shí)際運(yùn)輸保存條件，測(cè)試其穩(wěn)定性。隨機(jī)抽取制備好的能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品，在以下3種條件下各放置10支：室溫（20℃～25℃），相對(duì)濕度20%～50%，14 d取出進(jìn)行測(cè)試；冰箱冷藏（溫度2℃～8℃），14 d取出進(jìn)行測(cè)試；對(duì)照（-20℃），長(zhǎng)期放置保存。應(yīng)用PRV熒光PCR檢測(cè)，對(duì)獲得的Ct值采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗(yàn)-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析樣品的穩(wěn)定性。

1.6 能力驗(yàn)證的實(shí)施

1.6.1 組織形式本次能力驗(yàn)證為自愿參與，北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心作為CNAS認(rèn)可的能力驗(yàn)證提供者，統(tǒng)一提供上述制備的PRV能力驗(yàn)證陽(yáng)性和陰性樣品，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)發(fā)放6個(gè)樣品（至少含1個(gè)陰性樣品），不指定方法，也不提供試劑盒；參試實(shí)驗(yàn)室根據(jù)實(shí)際情況選擇不同方法和檢測(cè)試劑，以客觀反映實(shí)驗(yàn)室偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)的真實(shí)狀態(tài)，檢測(cè)完畢結(jié)果報(bào)驗(yàn)證單位審核評(píng)價(jià)。

1.6.2 參試實(shí)驗(yàn)室及參試方法本次能力驗(yàn)證計(jì)劃為自愿參加，共有分別來自上海、廣東和吉林3個(gè)省的7家來自動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心的實(shí)驗(yàn)室參加了能力驗(yàn)證。所有參試實(shí)驗(yàn)室均報(bào)送了有效結(jié)果。參試檢測(cè)方法有2種：方法1，偽狂犬病病毒普通PCR檢測(cè)技術(shù)；方法2，偽狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)。

1.6.3 能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)本次能力驗(yàn)證計(jì)劃是對(duì)豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)的定性判定，以實(shí)施機(jī)構(gòu)報(bào)送的測(cè)試結(jié)果為依據(jù)，對(duì)驗(yàn)證結(jié)果給予評(píng)價(jià)，如全部樣品檢測(cè)結(jié)果與樣品背景相符判定為滿意，如有不相符（假陰性或假陽(yáng)性）的樣品，則判為不滿。熒光PCR的Ct值僅作為參考，不予評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 能力驗(yàn)證樣品的制備將PRV南陽(yáng)株接種PK15細(xì)胞，48 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，細(xì)胞腫脹變圓，開始呈散在的灶狀，并逐漸擴(kuò)展，細(xì)胞不斷圓縮脫落，同時(shí)有大量多核巨細(xì)胞形成。收取PRV細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)56℃水浴箱滅活30min后，再次接種PK15細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞病變，表明病毒已滅活完全，無(wú)生物傳染性，可用于制備能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品。

將滅活的PRV培養(yǎng)液用PBS做10倍系列稀釋，采用熒光PCR和普通PCR檢測(cè)，結(jié)果熒光PCR最低可檢測(cè)108稀釋的PRV病毒培養(yǎng)液，而普通PCR最低能檢測(cè)到105稀釋的PRV培養(yǎng)液。在保證樣品經(jīng)熒光PCR和普通PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性的條件下，我們將PRV細(xì)胞培養(yǎng)液做105倍稀釋，混勻后分裝作為能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品。見圖1、2。

圖1 熒光PCR對(duì)10倍梯度稀釋PRV病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)

2.2 均勻性檢測(cè)隨機(jī)抽取制備好的能力驗(yàn)證陽(yáng)性和陰性樣品各10管，提取DNA，用偽狂犬病病毒熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)獲得的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果陽(yáng)性樣品各管間變異系數(shù)為1.70%（見表2），小于5%，表明樣品間差異不顯著，樣品均勻性良好。陰性樣品經(jīng)檢測(cè)無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，均為陰性。

圖2 普通PCR對(duì)10倍梯度稀釋PRV細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)M：DL-2 000DNAMarker；N：Negtive control；1～6：101～106diluted PRV

表2 能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品均勻性檢驗(yàn)

2.3 穩(wěn)定性檢測(cè)將制備的能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品分別在室溫、2℃～8℃和-20℃（對(duì)照）保存一定時(shí)間，之后提取DNA進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)組與對(duì)照組（-20℃）數(shù)據(jù)作t檢驗(yàn)分析，結(jié)果檢測(cè)組與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.5），表明樣品20℃～25℃和2℃～8℃保存14 d，穩(wěn)定性很好，可以滿足能力驗(yàn)證樣品傳遞的要求，見表3。

表3 能力驗(yàn)證樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性研究

2.4 能力驗(yàn)證結(jié)果本次能力驗(yàn)證共有7家實(shí)驗(yàn)室參試，其中有2家實(shí)驗(yàn)室選擇了普通PCR檢測(cè)方法，5家實(shí)驗(yàn)室選擇了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。7家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果滿意，見表4。

表4 能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)匯總

3 討論

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室管理部門、實(shí)驗(yàn)室用戶和認(rèn)可機(jī)構(gòu)判定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要手段，也是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的必要組成部分。北京出入境檢驗(yàn)檢疫局是CNAS認(rèn)可的能力驗(yàn)證計(jì)劃提供者（CNASPT0012），根據(jù)實(shí)際需要，我們組織實(shí)施了此次《豬偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)》能力驗(yàn)證計(jì)劃。

普通PCR和熒光PCR技術(shù)是應(yīng)用于偽狂犬病病毒核酸檢測(cè)的主要方法，也是本次能力驗(yàn)證考核的技術(shù)指標(biāo)。我們利用滅活的偽狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)物制備了能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品，并對(duì)滅活效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，經(jīng)檢測(cè)病毒完全滅活，確保了能力驗(yàn)證實(shí)施過程的生物安全。此外，在能力驗(yàn)證樣品的制備上，我們兼顧兩種不同方法的敏感性，選擇了合適濃度的病毒作為陽(yáng)性樣品。均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，制備的能力驗(yàn)證樣品，達(dá)到了中國(guó)合格評(píng)定委員會(huì)對(duì)能力驗(yàn)證樣品的要求［5］。

本次能力驗(yàn)證計(jì)劃為自愿參加，共有7家實(shí)驗(yàn)室參試，均獲得了滿意的結(jié)果，預(yù)示我國(guó)現(xiàn)有的動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)和出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心均具備開展偽狂犬病疫情監(jiān)測(cè)和診斷的能力。鑒于熒光PCR方法比與普通PCR方法更加簡(jiǎn)便、快速和靈敏，參試實(shí)驗(yàn)室中有5家選擇了熒光PCR方法，僅有2家選擇了普通PCR方法，這也表明隨著實(shí)驗(yàn)室條件的改進(jìn)，自動(dòng)化、高靈敏的熒光PCR成為PRV核酸檢測(cè)技術(shù)的首選。但鑒于當(dāng)前用于偽狂犬病病毒檢測(cè)的普通PCR方法已經(jīng)有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但熒光PCR方法還缺泛相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，建議及時(shí)制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)以指導(dǎo)該方法在臨床檢測(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化使用。

［1］甘孟侯，楊漢春.中國(guó)豬病學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：117-182.

［2］鄧仕偉，汪勇，薛春芳.我國(guó)偽狂犬病流行現(xiàn)狀及新特點(diǎn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（9）：105-107.

［3］OIE.TerrestrialManualChapter 2.1.2-Aujeszky′s disease［EB/OL］2.0http：//www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/ 2012，2.01.02_AUJESZKYS_DIS.pdf.

［4］朱淑芬，朱瑞良，喬彩霞，等.檢測(cè)偽狂犬病毒gB基因熒光定量PCR方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（10）：1413-1417.

［5］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南［EB/OL］.http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/nlyzxgzcyzl/ images/2012/11/30/4531B182D5936810C8AD6519B4F6897E.pdf CNAS—GL03:1-7，2006-6.

Development and application evaluation of sam ples for proficiency testing for Pseudorabies Virus nucleic acid detection

QIAOCai-xia，YIN Yi，PU Jing，GAO Zhi-qiang，WANG Lin，REN Tong，ZHANGWei，ZHANG Li-feng，ZHANG He-xiao
（Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）

Appraisal sample preparation was the focal point and core of the Proficiency Testing（PT）program for pathogen nu?cleic acid assay.In this study，we used cell cultures of pseudorabies virus Nanyang strain as originalmaterials，and prepared the test samples of nucleic acid assay for pseudorabies virus by dry heat inactivated viruses.Based on the results of uniformityand sta?bility test，the samplesmet the needs of China national accreditation service for conformity assessment，and could be used for Profi?ciency Testing（PT）program of nucleic acid assay of pseudorabies（BIQTC-2013-01）.A total of seven labs participated in the PT program and feedback the results，and the satisfactory ratewas 100%.In summary，we developed test samples and used them in the appraisal program of nucleic acid assay for pseudorabies virus，which lays the foundations for the certification and accreditation of laboratory testingmethods.

pseudrabiesvirus；nucleic acid test；proficiency testing

ZHENGHe-xiao

S852.659

A

0529-6005（2015）12-0006-04

2015-06-11

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)《動(dòng)物疫病核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備關(guān)鍵技術(shù)研究》（201310253）

喬彩霞（1978-），女，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)研究，E-mail：qiaocx@bjciq.gov.cn

張鶴曉，E-mail：aqlzhx@126.com