Real-time PCR方法檢測高脂飼喂小鼠肝臟CYP2A5的表達

齊 悅，張秀英，徐 尚，李廣亮

Real-time PCR方法檢測高脂飼喂小鼠肝臟CYP2A5的表達

齊 悅，張秀英，徐 尚，李廣亮

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為了建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型小鼠肝組織中CYP2A5表達的實時熒光定量PCR（real-time fluores?cence quantitative PCR，qRT-PCR）方法。高脂飲食誘導(dǎo)小鼠至8周，采用qRT-PCR方法檢測小鼠肝臟中CYP2A5的表達水平，同時評價該方法的特異性。建立了小鼠肝組織中CYP2A5的SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法，結(jié)果顯示，該方法的溶解曲線為單峰，同時核酸電泳顯示一條特異性條帶。檢測結(jié)果表明，高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝組織中CYP2A5的表達水平極明顯高于正常對照組（P＜0.01）。表明該實時熒光定量PCR方法，特異性好、靈敏度強，為進一步研究小鼠CYP2A5的表達提供了試驗基礎(chǔ)。

CYP2A5；實時熒光定量PCR；NAFLD

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種無過量飲酒史，肝實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。隨著人類生活水平的提高，NAFLD的發(fā)病率逐年增加，已成為一種危害人類健康的常見慢性肝臟疾?。?］。細胞色素P450（Cytochrome P450）屬于亞鐵血紅素單加氧酶超家族，是主要的一相代謝酶類，其介導(dǎo)的外源化合物代謝是肝臟解毒系統(tǒng)中重要的一部分。CYP2A5是鼠類CYP450酶系中的重要成員之一，與人類CYP2A6同源，在

蛋白質(zhì)序列和底物特異性上，與CYP2A6、CYP2A13高度相似，并且有相同的代謝底物，包括香豆素、尼古丁、可替寧、睪丸素、煙草類致癌物及亞硝胺類等。機體內(nèi)CYP2A5的表達變化對藥物代謝及外源性化合物的毒性有重要的影響［2］。本研究通過Real-Time PCR技術(shù)，對正常組、模型組小鼠肝組織中CYP2A5基因表達情況進行對比分析，目的是探討高脂誘導(dǎo)的NAFLD對CYP2A5表達的影響，為進一步揭示NAFLD發(fā)病機制、指導(dǎo)臨床合理用藥、新藥研發(fā)、疾病控制等方面提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物四周齡ICR鼠30只，購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心，隨機分為兩組，正常對照組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，NAFLD組小鼠飼喂高脂飼料，在基礎(chǔ)飼料（68.5%）中加入15%豬油1%膽固醇0.5%膽鹽15%糊精，高脂飼料的配方由前期試驗確定［3］。

1.2 主要試劑和儀器TRIZol提取液（Invitrogen公司）；一步法cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（?；锟萍加邢薰荆?；SYBR Premix Ex TaqTM、DNA Marker DL-2 000寶生物工程（大連）有限公司；臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司產(chǎn)品）；S1000 Thermal Cyclery型PCR儀（美國Bio-RAD公司產(chǎn)品）；NanoDrop2000核酸蛋白分光光度計，美國Thermo公司產(chǎn)品；ABI 7500熒光定量PCR（ABI公司，美國）；自動凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計及合成根據(jù)GenBank上CYP2A5和GAPDH基因核酸序列，利用Primer5.0和Oligo 6.0，在保守區(qū)分別設(shè)計一對特異性引物，序列如表1所示。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 RNA提取及cDNA合成取0.1g左右的肝組織放入勻漿器中，加入1mLTRIZol勻漿，靜置10min；加入0.2mL氯仿劇烈震蕩15 s，室溫靜置10min、離心取上清；加入等體積（約0.5mL）異丙醇沉淀RNA；75%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入0.1mLDEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計分析RNA濃度和純度，A260/A280在1.8～2.0之間。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。cDNA的合成參照試劑盒說明書進行。1.5 SYBRGreen實時熒光定量PCR條件優(yōu)化采用SYBR GreenⅠ染料法，對CYP2A5及內(nèi)參基因GAPDH的熒光定量PCR條件進行優(yōu)化，按照退火溫度55℃～65℃，引物濃度從0.4～1.0μmol/L進行20μL體系擴增，以擴增曲線平滑完整、得到最小的Ct值及最大的熒光值（Rn），溶解曲線產(chǎn)生特異性單峰為指標，同時通過瓊脂糖凝膠電泳分析熒光定量PCR產(chǎn)物特異性，以確定最佳擴增條件。經(jīng)優(yōu)化之后的反應(yīng)體系為：SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μL，上下游引物各0.8μL（10μmol/L），ROX Reference Dye（50）0.4μL，模板1μL，用滅菌的去離子水補足體系至20μL?？焖貾CR反應(yīng)條件：第一步95℃預(yù)變性30 s；第二步95℃變性5 s、60℃34 s、共40個循環(huán)。

表1 Rea l-time RT-PCR檢測中的引物序列

各個樣品的GADPH和CYP2A5基因分別在不同孔中進行擴增，根據(jù)各個樣品PCR反應(yīng)的Ct值進行相對定量。每份樣品目的基因CYP2A5的表達強度用其對應(yīng)的內(nèi)參基因GAPDH的量進行矯正，即ΔCt為目的基因相對于內(nèi)參基因的表達強度，ΔCt=Ct（CYP2A5基因）-Ct（GAPDH基因）。CYP2A5基因在NAFLD肝組織中相對于正常組織的表達差異倍數(shù)用2-ΔΔCt計算表示，而-ΔΔCt=-（ΔCt NAFLD肝組織-ΔCt正常肝組織）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)都用均值±標準差（mean±SD）的形式表示。用SPASS 17.0軟件進行多個樣本間單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量鑒定提取的總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，28s和18s RNA的電泳條帶清晰完整，且含量接近于2∶1，說明提取的RNA純度高完整性好，沒有發(fā)生降解。NanoDrop2000核酸蛋白分光光度計檢測，如圖1所示，吸光光譜的曲線平滑，在260 nm波長處出現(xiàn)單峰，A260/A280的比值介于1.8～2.0之間。

圖1 NanoDrop2000檢測總RNA吸光曲線

2.2 實時熒光定量PCR條件優(yōu)化Real-time PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖顯示（圖2、圖3），在0.8μL（10 μmol/L）引物、60℃退火溫度下，CYP2A5和GAPDH兩基因均能獲得較好的特異性和靈敏度，兩種基因在同一條件下能獲得較好的特異性和靈敏度。

圖2 CYP2A5 Rea l-Time PCR條件優(yōu)化

圖3 GAPDH Real-Time PCR條件優(yōu)化

2.3 CYP2A5和GAPDH兩基因擴增曲線及溶解曲線CYP2A5和GAPDH兩基因的擴增曲線基本平行，擴增效率一致，可以用2-ΔΔCt方法計算分析。兩基因的溶解曲線如圖4、圖5所示，兩者均為單峰，提示擴增產(chǎn)物特異性較好。

2.4 高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟中CYP2A5 mRNA的相對表達如表2所示，與正常組小鼠相比，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟組織中CYP2A5的相對表達水平明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 實時熒光定量PCR CYP2A5基因溶解曲線

圖5 實時熒光定量PCR GAPDH基因溶解曲線

表2 高脂組和正常組小鼠肝臟中CYP2A5的相對表達量

3 討論

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）被認為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，通過促進肝臟脂肪變性、細胞損傷和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）是體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵靶點，其可以通過促進多種抗氧化酶和II相解毒酶的表達，發(fā)揮重要的抗氧化作用［4］。本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生NAFLD，模型小鼠Nrf2的表達量增加，Nrf2缺失會加重脂質(zhì)的沉積和氧化應(yīng)激，加速NAFLD的形成。

細胞色素P450超家族中，CYP2A5的調(diào)節(jié)作用不同于大多數(shù)CYP酶類，可被一些結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)物質(zhì)高度誘導(dǎo)。所有條件下CYP2A5誘導(dǎo)作用不是化學(xué)物質(zhì)本身的作用［5］，而是這些化學(xué)物質(zhì)引起的肝毒性或肝組織損傷作用的結(jié)果，在炎癥和肝硬化區(qū)域相鄰的肝細胞CYP2A5為增量調(diào)節(jié)。這與本試驗結(jié)果相互印證，NAFLD發(fā)生時，機體由活性氧ROS產(chǎn)生損傷或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，血紅素降低，膽紅素升高，可誘導(dǎo)CYP2A5的表達。CYP2A5活性的增強可能是保護細胞反應(yīng)［6］。

CYP2A5是Nrf2的一個高度敏感的靶基因，Nrf2可能部分或全部的調(diào)控著CYP2A5的表達［7］。即使是在特殊物質(zhì)的誘導(dǎo)下，如吡唑，通過hnRNPA1調(diào)控CYP2A5的轉(zhuǎn)錄后表達，也可能涉及Nrf2的作用［8］。CYP2A5在血紅素平衡中起重要作用，不僅可作為血紅素螯合蛋白，而且可催化膽紅素。當線粒體受到過量血紅素、膽紅素或血紅素中間體威脅時，Nrf2可維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中CYP2A5的組成型表達［9］。本試驗中NAFLD小鼠CYP2A5表達水平顯著升高，可能與Nrf2的調(diào)節(jié)密不可分。

本試驗采用前期建立的方法，通過給小鼠飼喂高脂飼料建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，組織病理學(xué)檢查及生化檢查證明模型鼠的肝臟發(fā)生脂肪變性［10］。用RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，與正常飲食小鼠相比，高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝組織中CYP2A5的相對表達水平顯著升高。同時本研究建立了一種Real-time PCR方法檢測小鼠肝組織中CYP2A5的表達水平，該方法特異性好，靈敏度強，為今后研究CYP2A5表達通路及NAFLD發(fā)病機制提供了良好的試驗基礎(chǔ)。

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Real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection of high-fat feedingmurine liver tissue CYP2A5 expression

QIYue，ZHANG Xiu-ying，XU Shang，LIGuang-liang
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to establish real-time fluorescence quantitative PCRmethod for detection liver CYP2A5 expression of non?alcoholic fatty liver disease（NAFLD）mousemodel of NAFLD was induced with high fat diet for eightweeks.The relative expres?sion level ofmouse CYP2A5 in liver tissue was detected by qRT-PCR.The sensitivity and specificity of thismethod were evaluat?ed.The real-time fluorescence quantitative PCR method for detection liver CYP2A5 expression of NAFLD was established.The melting curve showed single peak and the amplified products were electrophoresed and a single productwas observed.Compared to the controlmice，the CYP2A5 relative expression was significantly increased in NAFLDmice liver tissue（P＜0.01）.Thus a stan?dardmethod of qRT-PCR can be used for the detection ofmouse CYP2A5 expression due to its good specificity and sensitivity.

CYP2A5；real-time fluorescence quantitative PCR；NAFLD

ZHANG Xiu-ying

R 575.5

A

0529-6005（2015）12-0003-03

2014-10-27

國家自然科學(xué)基金（31172369）

齊悅（1990-），女，碩士生，研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail：yue7yue@hotmail.com

張秀英，E-mail：zhangxiuying@neau.edu.cn