杜氏鹽藻環(huán)盒子1相互作用蛋白的酵母雙雜交法篩選*

許 堯,張楠楠，張彥婷，李慶華，楊 露，朱相展，薛樂(lè)勛#，關(guān)方霞1,#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

杜氏鹽藻環(huán)盒子1相互作用蛋白的酵母雙雜交法篩選*

許 堯1),張楠楠2)，張彥婷1)，李慶華1)，楊 露1)，朱相展1)，薛樂(lè)勛1)#，關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

#通信作者：薛樂(lè)勛，男，1944年2月生，教授，研究方向：腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn;關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)與應(yīng)用，E-mail:guanfangxia@126.com

酵母雙雜交；杜氏鹽藻；誘餌載體；自激活；環(huán)盒子1

目的：構(gòu)建杜氏鹽藻環(huán)盒子1(RBX1)的酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-RBX1，篩選與RBX1相互作用的蛋白。方法：采用PCR技術(shù)擴(kuò)增杜氏鹽藻RBX1的開(kāi)放閱讀框，測(cè)序分析后插入酵母表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-RBX1。將酶切鑒定正確的誘餌載體用PEG/LiAc法分別轉(zhuǎn)化到酵母菌Y187和AH109中，通過(guò)表型篩選檢測(cè)RBX1對(duì)酵母菌有無(wú)自激活和毒性作用。轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的Y187與文庫(kù)菌AH109雜交，待三葉草形狀的合子形成后用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和α-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。結(jié)果：成功構(gòu)建了pGBKT7-RBX1，它對(duì)Y187和AH109兩種酵母菌既無(wú)自激活又無(wú)毒性作用。雜交后篩選得到兩個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆1與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基的同源性為38%和39%，陽(yáng)性克隆2與萊茵衣藻中轉(zhuǎn)化抑制劑蛋白的同源性為57%。結(jié)論：誘餌載體pGBKT7-RBX1可用于酵母雙雜交。成功篩選得到兩個(gè)陽(yáng)性克隆，可能是與RBX1相互作用的蛋白。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是細(xì)胞內(nèi)蛋白選擇性降解的重要途徑，其功能失調(diào)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤發(fā)生時(shí)，泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑在細(xì)胞周期紊亂、DNA損傷和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[2]。環(huán)盒子1(ring-box 1,RBX1)是SCF-E3泛素-蛋白連接酶復(fù)合體中的指環(huán)亞基，通過(guò)靶向降解不同的底物蛋白而發(fā)揮調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的作用[3-4]。RBX1存在于動(dòng)植物的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，進(jìn)化上比較保守。人的RBX1包含一個(gè)環(huán)指-H2 的結(jié)構(gòu)域，對(duì)鋅離子結(jié)合和泛素連接是必需的[5-6]。作為泛素連接酶 E3 的重要組成部分，RBX1在腫瘤發(fā)生時(shí)表達(dá)異常而無(wú)法產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老和凋亡，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，但具體分子機(jī)制尚不清楚。腫瘤發(fā)生與纖毛異常密切相關(guān)。然而，在人類細(xì)胞中進(jìn)行纖毛的研究比較困難，而杜氏鹽藻以其無(wú)細(xì)胞壁、有一對(duì)等長(zhǎng)的鞭毛、生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為鞭毛研究的模式生物[7]。作者所在的實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)RBX1可能參與了鞭毛的再生過(guò)程，為揭示RBX1的生物學(xué)功能及腫瘤的發(fā)生機(jī)制提供了新的視野。該實(shí)驗(yàn)以杜氏鹽藻為模式生物，利用酵母雙雜交技術(shù)[8]，通過(guò)構(gòu)建杜氏鹽藻RBX1酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-RBX1，分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187和AH109并檢測(cè)其對(duì)酵母菌株有無(wú)自激活和毒性作用，轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的Y187與文庫(kù)菌AH109雜交，待三葉草形狀的合子形成后用α-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，尋找RBX1相互作用蛋白，并為研究其在杜氏鹽藻鞭毛再生中的功能做基礎(chǔ)性工作。

1 材料與方法

1.1 藻體、菌株和主要試劑 大腸桿菌DH5α系鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞生物學(xué)研究室保存；杜氏鹽藻藻株UTEX LB-1644購(gòu)于美國(guó)得克薩斯州大學(xué)；杜氏鹽藻cDNA酵母文庫(kù)由作者所在的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；誘餌載體pGBKT7、酵母菌株Y187和AH109購(gòu)于Clontech公司；pMD19-T simple、pUCm-T購(gòu)于Sangon公司；誘餌載體pGEM-T Easy購(gòu)于Promega公司；Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；YPDA液體和固體培養(yǎng)基以及DO Supplement系列酵母培養(yǎng)基均購(gòu)于上海Genomics公司；X-gal、X-α-gal、DMSO均購(gòu)自Sigma公司；PCR特異性引物由Sangon公司合成；EcoRⅠ、PstⅠ、T4 DNA連接酶、DNA Marker、AMV cDNA 第一鏈合成試劑盒均購(gòu)于大連TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；紫外分光光度儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；PCR儀購(gòu)于Biometra公司；凝膠成像儀購(gòu)于Synopticsltd公司；DYY-8C型電泳儀購(gòu)于北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 杜氏鹽藻RBX1開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增 根據(jù)pGBKT7載體上的多克隆位點(diǎn)和杜氏鹽藻RBX1 cDNA序列，設(shè)計(jì)上下游分別含有EcoRⅠ與PstⅠ位點(diǎn)的特異性引物。RBX1-ORF-F-S1:5’-GGAAT TCATGAGTGCTGCTGCTGAGG-3’(EcoRⅠ)；RBX1-ORF-R-S2:5’-AACTGCAGCTAGTCCAGCCCAACAGC C-3’(PstⅠ)。杜氏鹽藻總RNA的提取方法根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)RNA的完整性和純度，然后根據(jù)AMV cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模版，PCR擴(kuò)增RBX1開(kāi)放閱讀框。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(100 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 nmol/L) 8 μL，LA Taq酶0.5 μL，模版cDNA 1 μL，10×LA PCR Buffer 10 μL，加ddH2O補(bǔ)至100 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 pMD19-T-RBX1的獲得與鑒定 PCR產(chǎn)物膠回收后的目的片段與克隆載體pMD19-T simple于4 ℃連接12 h，獲得載體pMD19-T-RBX1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal)上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色飽滿的單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)7～9 h后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ與PstⅠ進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定正確后回收目的片段，同時(shí)將菌液送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.4 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-RBX1的構(gòu)建

將鑒定正確的pMD19-T-RBX1與誘餌載體pGBKT7用EcoRⅠ和PstⅠ分別過(guò)夜雙酶切，回收RBX1片段和pGBKT7片段，用T4 DNA連接酶連接(4 ℃連接12 h)并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有卡那霉素)上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取白色飽滿的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pGBKT7-RBX1，經(jīng)雙酶切鑒定正確后送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.5 誘餌載體pGBKT7-RBX1的轉(zhuǎn)化

1.5.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 采用醋酸鋰法分別制備酵母Y187和AH109的感受態(tài)細(xì)胞，劃線于YPDA固體培養(yǎng)基至長(zhǎng)出2 mm克隆后，挑取單克隆接種于3 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、230～250 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)16～20 h至光密度值(OD)600 nm達(dá)到0.15～0.30，然后接種于50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)到0.40～0.50(約4 h)。室溫、2 500 r/min將菌液離心5 min，棄上清，加30 mL去離子水輕輕重懸沉淀，再次離心棄上清，用3 mL 1.1×TE/LiAc溶液重懸沉淀。將酵母細(xì)胞分裝于1.5 mL的EP管中，11 000 r/min離心20 s，棄上清，加600 μL 1.1×TE/LiAc溶液重懸細(xì)胞，所得細(xì)胞懸浮液即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.5.2 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母菌及陽(yáng)性克隆的鑒定 在1.5 mL的EP管中加入50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞、500 μL PEG/LiAc溶液、0.5 μL pGBKT7-RBX1和5 μL鮭魚(yú)精DNA(10 g/L)，渦旋混勻。將EP管置于30 ℃水浴鍋中孵育30 min。向EP管中加入20 μL DMSO，混勻，42 ℃水浴15 min(每5 min渦旋1次)，然后迅速放冰上2 min。將混合液13 000 r/min離心15 s，棄上清，用1 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30 ℃溫浴90 min，13 000 r/min離心15 s，棄上清，用生理鹽水溶液重懸。將菌液均勻涂布于相應(yīng)的SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2～4 d，直至長(zhǎng)出單菌落。挑取直徑大于2 mm的單克隆進(jìn)行菌落PCR，檢測(cè)誘餌載體是否成功轉(zhuǎn)入酵母菌中。

1.6 毒性鑒定 將含有pGBKT7-RBX1的Y187和AH109分別劃線于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出白色單克隆，挑取單克隆分別接種于5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)16 h后測(cè)OD600 nm，若酵母OD600 nm低于0.8，說(shuō)明誘餌蛋白對(duì)酵母菌株的生長(zhǎng)有毒性作用，不適用于酵母雙雜交系統(tǒng)。

1.7 自激活檢測(cè) 將含有pGBKT7-RBX1和空載體pGBKT7的Y187和AH109分別劃線于營(yíng)養(yǎng)缺陷型(SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp/-Ade/X-α-gal、SD/-Trp/-His/X-α-gal)固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2～4 d后觀察酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。若酵母菌能夠在SD/-Trp/-His/X-α-gal固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則需要在酵母雙雜交過(guò)程中加入His抑制劑3-AT。若菌株能夠在SD/-Trp/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則誘餌蛋白具有自激活作用，不適用于酵母雙雜交系統(tǒng)。

1.8 酵母雙雜交 取1 mL文庫(kù)菌(AH109)在冰上融化后與轉(zhuǎn)化pGBKT7-RBX1的Y187共同轉(zhuǎn)接于5 mL 2×YPDA/Kanr液體培養(yǎng)基中，30℃、30～50 r/min溫和旋轉(zhuǎn)孵育，22 h后取少量菌液進(jìn)行鏡檢，觀察是否有三葉草形狀的合子形成。雜交后的菌液涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)6～8 d至克隆出現(xiàn)。挑取直徑大于2 mm的單克隆劃線于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)接5代后，仍正常生長(zhǎng)且為藍(lán)色克隆則認(rèn)為是篩選得到的陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性克隆作為模板進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增得到的片段膠回收后與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，酶切鑒定，并將菌液送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序和進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻RBX1的擴(kuò)增及鑒定 用引物S1和S2、以鹽藻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小約為400 bp(圖1)，測(cè)序證實(shí)為420 bp，與預(yù)期大小一致。膠回收后將目的片段連接到pMD19-T simple載體，pMD19-T-RBX1質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，一條帶約為3 000 bp(為線性pMD19-T simple載體)，另一條帶約為420 bp(為插入的RBX1片段)；測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入的RBX1沒(méi)有發(fā)生突變。

2.2 誘餌載體pGBKT7-RBX1的鑒定 pGBKT7-RBX1雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳(圖3)顯示為兩條帶，一條約為7 300 bp(為線性pGBKT7載體)，另一條約為420 bp(為插入的RBX1 cDNA片段)。對(duì)pGBKT7-RBX1進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示RBX1片段已插入到pGBKT7載體的多克隆位點(diǎn)中，且序列正確，無(wú)有義突變，酵母雙雜交誘餌載體構(gòu)建成功。

圖1 RBX1開(kāi)放閱讀框的PCR結(jié)果

圖2 pMD19-T-RBX1質(zhì)粒雙酶切

M：Marker；1：pMD19-T-RBX1；2：pMD19-T-RBX1經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切。

圖3 pGBKT7-RBX1酶切鑒定結(jié)果

M：Marker；1：pGBKT7-RBX1；2：pGBKT7-RBX1經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切。

2.3 pGBKT7-RBX1的轉(zhuǎn)化 用引物S1和S2對(duì)轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞進(jìn)行菌落PCR，電泳結(jié)果(圖4)顯示產(chǎn)物大小約為400 bp，經(jīng)測(cè)序證實(shí)產(chǎn)物大小為420 bp，與預(yù)期大小一致，說(shuō)明誘餌載體pGBKT7-RBX1已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞中。

圖4 pGBKT7-RBX1轉(zhuǎn)化酵母菌菌落PCR結(jié)果

M：Marker；1：pGBKT7-RBX1轉(zhuǎn)化Y187；2：pGBKT7-RBX1轉(zhuǎn)化AH109。

2.4 毒性鑒定及自激活檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 誘餌蛋白的毒性檢測(cè) 將轉(zhuǎn)化pGBKT7-RBX1的Y187和AH109分別接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基16 h后，測(cè)得OD600 nm分別為1.156和1.149，說(shuō)明誘餌蛋白R(shí)BX1對(duì)酵母菌均無(wú)毒性作用。

2.4.2 自激活檢測(cè) 將轉(zhuǎn)化誘餌載體和空載體的Y187和AH109分別劃線于各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)結(jié)果(圖5)顯示：在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)基上可以長(zhǎng)出白色單菌落；在SD/-Trp/-His/X-α-gal以及SD/-Trp/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)基上酵母菌不能生長(zhǎng)。說(shuō)明所構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-RBX1對(duì)酵母菌無(wú)自激活作用，可用于酵母雙雜交系統(tǒng)。

圖5 自激活實(shí)驗(yàn)

2.5 酵母雙雜交結(jié)果

2.5.1 雙雜交配子形成檢測(cè) 誘餌菌Y187與文庫(kù)菌AH109雜交，振蕩培養(yǎng)22 h后，取少量菌液進(jìn)行鏡檢，能夠觀察到大量的三葉草形狀的合子出現(xiàn)，說(shuō)明酵母雙雜交成功，可以進(jìn)行下一步的篩選。

2.5.2 酵母雙雜交陽(yáng)性克隆的鑒定 雜交菌液在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5代后，仍有兩個(gè)菌落為藍(lán)色，即為篩選得到的陽(yáng)性克隆(圖6)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR，分別得到約900和600 bp大小的片段(圖7)，兩者分別命名為陽(yáng)性克隆1和陽(yáng)性克隆2。經(jīng)測(cè)序鑒定和同源性比對(duì)分析，陽(yáng)性克隆1與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基同源性分別為38%和39%，陽(yáng)性克隆2與萊茵衣藻中轉(zhuǎn)化抑制劑蛋白同源性為57%。

圖6 酵母雙雜交陽(yáng)性克隆的篩選

圖7 陽(yáng)性克隆菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)是將目的蛋白的cDNA序列克隆至含轉(zhuǎn)錄激活因子(例如GAL4)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因的酵母表達(dá)載體中,獲得融合誘餌表達(dá)載體,將待測(cè)cDNA文庫(kù)克隆至含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體中，二者共轉(zhuǎn)化酵母菌，通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)分析，篩選目的蛋白的互作蛋白[9]。酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中存在的主要問(wèn)題是假陽(yáng)性較多,即當(dāng)兩個(gè)蛋白之間沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí),報(bào)告基因也被激活。造成假陽(yáng)性的原因主要是誘餌蛋白本身可以激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，所以必須通過(guò)自激活驗(yàn)證誘餌蛋白是否可用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)[10]。此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須嚴(yán)格設(shè)置對(duì)照，運(yùn)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選并連續(xù)傳代以增強(qiáng)篩選能力，從而盡量排除假陽(yáng)性結(jié)果。

該研究成功構(gòu)建了含有RBX1基因開(kāi)放閱讀框的酵母誘餌載體pGBKT7-RBX1，并將誘餌載體分別轉(zhuǎn)入到酵母菌Y187和AH109中，毒性檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化誘餌載體的AH109和Y187培養(yǎng)后OD600 nm均大于0.8，說(shuō)明RBX1對(duì)兩種酵母菌均無(wú)毒性作用。另外，為排除假陽(yáng)性結(jié)果，該研究檢測(cè)了誘餌載體pGBKT7-RBX1的自激活作用，結(jié)果表明RBX1對(duì)AH109與Y187均無(wú)自激活作用，可以用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化誘餌載體的Y187與文庫(kù)菌AH109雜交，待三葉草形狀的合子形成后用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和α-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，成功篩選到兩個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定和同源性分析，陽(yáng)性克隆1與萊茵衣藻和擬南芥中氧化還原酶鐵硫蛋白亞基同源性分別為38%和39%，陽(yáng)性克隆2與萊茵衣藻中轉(zhuǎn)化抑制劑蛋白同源性為57%。

作者初步獲得了可能與RBX1相互作用的兩個(gè)蛋白，后續(xù)研究需要通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)免疫共沉淀進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]Ciechanover A.The ubiquitin-proteasome pathway: on protein death and cell life[J].EMBO J,1998,17(24):7151

[2]Hershko A,Ciechanover A,Varshavsky A.Basic medical research award：The ubiquitin system[J].Nat Med,2000,6(10):1073

[3]Inoue Y,Imamura T.Regulation of TGF-beta family signaling by E3 ubiquitin ligases[J].Cancer Sci,2008,99(11):2107

[4]Petroski MD,Deshaies RJ.Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2005，6(1):9

[5]Jia L,Sun Y.SCF E3 ubiquitin ligases as anticancer targets[J].Curr Cancer Drug Targets,2011,11(3):347

[6]Tan M,Davis SW,Saunders TL,et al.RBX1/ROC1 disruption results in early embryonic lethality due to proliferation failure, partially rescued by simultaneous loss of p27[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(15):6203

[7]Singla V,Reiter JF.The primary cilium as the cell's antenna: signaling at a sensory organelle[J].Science,2006,313(5787):629

[8]Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J].Nature,1989,340(6230):245

[9]閻赟夢(mèng),李慶華,李杰,等.杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,46(4):517

[10]Ratushny V,Golemis E.Resolving the network of cell signaling pathways using the evolving yeast two-hybrid system[J].Biotechniques,2008,44(5):655

(2014-07-28收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Screening of proteins that interact with RBX1 from Dunaliella salina using yeast two-hybrid system

XUYao1),ZHANGNannan2),ZHANGYanting1),LIQinghua1),YANGLu1),ZHUXiangzhan1)XUE Lexun1)#,GUANFangxia1,2)

1)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

yeast two-hybrid;Dunaliella salina;bait vector;self-activation;ring-box 1

Aim: To screen the proteins that could interact with ring-box 1(RBX1) in Dunaliella salina, a bait vector pGBKT7-RBX1 for RBX1 from Dunaliella salina was constructed. Methods: As a model organism, the ORF of RBX1 from Dunaliella salina was obtained by PCR amplification and confirmed by sequencing, and then inserted into the yeast expression plasmid pGBKT7 to construct a recombinant bait vector pGBKT7-RBX1. After being identified by double digestion, the constructed bait vector was respectively transformed into the yeast strains Y187 and AH109 using PEG/LiAc method. Subsequently, the self-activation and toxicity were respectively examined by phenotype assay.Y187 transformed with bait vector was hybridized with AH109 transformed with the Dunaliella salina cDNA expression library.After the formation of the clover shaped zygote, positive clones were screened in auxotrophic medium by the active experiment of alpha galactosidase. Then the screened clones were sequenced. Results: The constructed bait vector of pGBKT7-RBX1 was successfully transformed into yeast strains Y187 and AH109. The expression products of the recombinant bait vector had no self-activation or toxic effects on neither Y187 nor AH109 strains. Sequence analysis on screened positive colonies showed that they were respectively homologous with ferredoxin thioredoxin reductase subunit from chlamydomonas reinhardtii and arabidopsis thaliana(38% and 39%) and translational inhibitor protein from chlamydomonas reinhardtii(51%).Conclusion: The bait vector pGBKT7-RBX1 could be used for yeast two-hybrid system, and two positive colonies were obtained.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.005

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700014;科技部國(guó)際科技合作基金資助項(xiàng)目 2007DFA01240

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