貢水白柚組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)

石開(kāi)明　方響亮

摘要：為了探明貢水白柚組織培養(yǎng)快速繁殖高效系統(tǒng)的培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)基配方，以沙田柚、蜜柚、紅心柚、玉環(huán)柚4個(gè)品種為材料，研究柚組織培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)。以4種柚成年嫁接樹(shù)梢尖、帶芽莖段為外植體，研究柚組織培養(yǎng)各環(huán)節(jié)的主要影響調(diào)控因子，建立有效貢水白柚組織培養(yǎng)快速繁殖體系。結(jié)果表明，柚種子發(fā)苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS培養(yǎng)基萌發(fā)后，再轉(zhuǎn)至固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)為宜；在激素配比中，最適合貢水白柚幼嫩莖段的6-BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度以0.2mg/L為佳；不同外植體的培養(yǎng)誘導(dǎo)率表明，用春梢嫩莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)出芽率高，生長(zhǎng)迅速。

關(guān)鍵詞：柚；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號(hào)： S666.304+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0031-03

收稿日期：2014-04-03

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：Q20122902）。

作者簡(jiǎn)介：石開(kāi)明（1980—），男，湖北大冶人，博士，講師，主要從事林學(xué)園藝植物遺傳育種研究。E-mail：skm331@163.com。

通信作者：方響亮，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事野生動(dòng)物植物保護(hù)與利用研究。E-mail：94486529@qq.com。柚子是蕓香科植物柚的成熟果實(shí)，柚果實(shí)清香、酸甜、涼潤(rùn)，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值很高，是人們喜食的名貴水果之一。柚果實(shí)是柑橘類果實(shí)中生長(zhǎng)周期最長(zhǎng)的品種，采摘期避開(kāi)了柑果上市“洪峰”，加上柚果大而皮厚，非常適合貯藏，生產(chǎn)上輔以適當(dāng)保鮮條件和貯藏調(diào)控庫(kù)的特殊處理，便可周年供應(yīng)，風(fēng)味不減，成為柑果類中的“天然罐頭”。

目前，國(guó)內(nèi)柚苗木繁殖技術(shù)還相對(duì)落后，各種保護(hù)技術(shù)措施不能得到落實(shí)，田間繁殖的柚苗木攜帶有很多病毒和病原體，在推廣過(guò)程中容易造成病原傳播，往往使得柚株生長(zhǎng)不良，樹(shù)勢(shì)衰弱，產(chǎn)量減少，品質(zhì)退化，給柚類生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以克服傳統(tǒng)苗木繁殖方法易帶毒的不足，同時(shí)能獲得基因型統(tǒng)一、表型優(yōu)良的一致性群體，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)良種柚的苗木進(jìn)行快速繁殖具有重要的意義。柑橘類組織培養(yǎng)快速繁殖研究，目前以甜橙和寬皮柑橘較多，關(guān)于柚的報(bào)道較少，一般也都是使用由種子萌發(fā)而產(chǎn)生的試管實(shí)生苗，并不能解決脫毒問(wèn)題。在已有的試管苗的組培微繁研究中，涉及到有關(guān)不同外植體、上下胚軸、子葉和根尖等不同部位對(duì)芽苗分化的影響。目前，我國(guó)在研究柚類組培方面的試驗(yàn)材料已有沙田柚、砧板柚、文旦柚、下河蜜柚、酸柚[1-5]等。通過(guò)實(shí)生繁殖要克服種子發(fā)芽的困難，嫁接無(wú)性繁殖用工成本高，不能適應(yīng)良種柚苗木的快速大量推廣和應(yīng)用。通過(guò)建立一套高速有效組織培養(yǎng)快速繁殖體系，才能克服上述弊端，從而為柚種質(zhì)資源的基礎(chǔ)研究、生產(chǎn)應(yīng)用提供一條更好的途徑。本研究分別以4個(gè)品種柚消毒的種子、營(yíng)養(yǎng)器官外植體為材料，研究種子組織培養(yǎng)、激素濃度配比以及不同部位對(duì)柚組培快速繁殖的交互影響。

1材料與方法

1.1材料

柚組織培養(yǎng)快速繁殖系統(tǒng)的建立以沙田柚、蜜柚、紅心柚、玉環(huán)柚成熟種子為試材。取成年柚子樹(shù)上嫩葉、嫩莖尖、帶芽莖段為外植體。柚嫁接樹(shù)外植體組織培養(yǎng)供試品種取材為已掛果的5年生蜜柚、紅心柚、沙田柚和玉環(huán)柚，取其梢尖、帶芽莖段為外植體。沙田柚由湖北民族學(xué)院柚子園提供，蜜柚、玉環(huán)柚、紅心柚由湖北省恩施市巴東縣園藝場(chǎng)提供。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)以MS和1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)各品種柚成熟和未成熟種子。

1.2.2不同激素濃度誘導(dǎo)不定芽以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同濃度6-BA和NAA，具體培養(yǎng)基組成見(jiàn)表1。

表1培養(yǎng)基激素濃度

序號(hào)激素濃度（mg/L）6-BANAA100.2200.5301.040.50.250.50.560.51.071.00.281.00.591.01.0

1.2.3不同外植體培養(yǎng)柚外植體的培養(yǎng)參見(jiàn)鄒金美等的方法[4]，在MS培養(yǎng)基上輔以0.5 mg/L 6-BA，0.2 mg/L NAA。4個(gè)品種柚莖尖、莖段各設(shè)40個(gè)外植體處理，在組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

1.3材料消毒

研究培養(yǎng)條件為白天25 ℃，夜晚18 ℃；光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx；光暗周期16 h/8 h；相對(duì)濕度80%。瓊脂用量為 6.0 g/L，培養(yǎng)基pH值5.8。相關(guān)化學(xué)試劑的配制：75%的乙醇、0.1%氯化汞、蒸餾水、MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基。莖尖消毒：一般先取較大的莖尖，表面消毒后，再在無(wú)菌條件下借助解剖顯微鏡取出所需大小的莖尖培養(yǎng)。莖尖表面消毒：從柚母株上剪下帶萌動(dòng)的飽滿芽嫩莖，作為外植體。先用蒸餾水浸泡3 min，再用流水沖洗30 min，用6%NaClO漂洗 10 min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用等體積75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次后，用0.1%L氯化汞滅菌10 min。剝?nèi)∩L(zhǎng)點(diǎn)，切取莖尖頂端1.5 mm分生組織，轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，無(wú)菌濾紙吸干水，接種至MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。莖尖的剝離：在剝?nèi)∏o尖時(shí)，把莖芽置于解剖鏡下，1只手用鑷子將其按住，另1只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針蘸入90%乙醇并用火焰灼燒進(jìn)行消毒。用解剖刀片切取分生組織時(shí)宜帶1～2張幼葉，接種微莖尖時(shí)確保不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。剝離莖尖時(shí)，應(yīng)盡快接種，防止莖尖變干。莖段消毒：取健壯無(wú)病蟲的幼嫩莖，去葉片剪成3～4 cm小段。在自來(lái)水中沖洗1～3 h，用75%乙醇滅菌30～60 s，再用0.1%氯化汞泡25 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～5次后接種。取材時(shí)優(yōu)先利用頂部的外植體，其次也可利用腋芽，取莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。

2結(jié)果與分析

2.1不同品種柚種子培養(yǎng)條件對(duì)種子萌發(fā)的影響

在固體和半固體的MS、1/2MS培養(yǎng)基上接種不同品種柚的成熟與未成熟種子做對(duì)比，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。固體1/2MS培養(yǎng)基是常用于種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。柚子在種子萌發(fā)階段，種子在半固體培養(yǎng)基中比在固體培養(yǎng)基中更容易啟動(dòng)萌發(fā)，這可能與半固體培養(yǎng)基有更好的流動(dòng)性有關(guān)，使?fàn)I養(yǎng)成分能與種子充分的接觸，更容易充分吸收營(yíng)養(yǎng)的MS培養(yǎng)基作為組培常用的培養(yǎng)基，萌發(fā)出的無(wú)菌苗比l/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的無(wú)菌苗更粗壯，這可能與MS培養(yǎng)基含有較高的無(wú)機(jī)元素有關(guān)。發(fā)苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)后，轉(zhuǎn)至固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。表2不同培養(yǎng)條件對(duì)種子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)基狀態(tài)種子類型品種萌發(fā)率（%）生長(zhǎng)情況1MS固體成熟沙田柚78.0bc萌發(fā)晚，生長(zhǎng)良好2MS固體成熟蜜柚67.0c萌發(fā)較早，部分黃化3MS固體成熟紅心柚86.6ab萌發(fā)早，生長(zhǎng)良好4MS固體成熟玉環(huán)柚72.0a萌發(fā)較早，生長(zhǎng)較好5MS半固體未成熟沙田柚82.0ab萌發(fā)早，生長(zhǎng)良好6MS半固體未成熟蜜柚76.0bc萌發(fā)早，生長(zhǎng)緩慢7MS半固體未成熟紅心柚81.3b萌發(fā)早，生長(zhǎng)較好8MS半固體未成熟玉環(huán)柚78.0bc萌發(fā)早，生長(zhǎng)緩慢91/2MS固體未成熟沙田柚88.0ab萌發(fā)較晚，幼苗較瘦弱101/2MS固體未成熟蜜柚96.0a萌發(fā)早，幼苗黃化、瘦弱111/2MS固體未成熟紅心柚84.3b萌發(fā)較晚，幼苗較瘦弱121/2MS固體未成熟玉環(huán)柚85.2b萌發(fā)較晚，幼苗瘦弱131/2MS半固體成熟沙田柚89.0ab萌發(fā)較早，幼苗瘦弱141/2MS半固體成熟蜜柚90.0a萌發(fā)較晚，幼苗瘦弱151/2MS半固體成熟紅心柚92.4a萌發(fā)較早，幼苗瘦弱161/2MS半固體成熟玉環(huán)柚91.4a萌發(fā)較晚，幼苗瘦弱注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表3、表4同。

2.2不同激素組合對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

不同激素濃度組合對(duì)幼嫩莖段誘導(dǎo)不定芽的影響見(jiàn)表3。當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA和NAA的濃度搭配處于較低范圍時(shí)，對(duì)外植體的出芽誘導(dǎo)影響不明顯；隨著激素濃度提高，外植體的誘導(dǎo)成活率卻有一定程度降低，激素濃度為最大組合 1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA時(shí)，外植體的芽誘導(dǎo)率為275%～30.0%。結(jié)果表明，在未添加激素的基本MS培養(yǎng)基中，出芽誘導(dǎo)率很低，為3.1%～4.8%，觀察到出芽的基本是由腋芽分化形成，未有通過(guò)不定芽誘導(dǎo)出芽的；在低濃度范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的上升，出芽率也隨之提高，當(dāng)6-BA增加到0.5 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出芽率達(dá)到90%以上，當(dāng)增加至10 mg/L時(shí)，出芽率下降至30%左右；單獨(dú)分析NAA的影響可知，當(dāng)添加1種激素NAA時(shí)，40個(gè)外植體最多誘導(dǎo)產(chǎn)生42個(gè)不定芽，誘導(dǎo)分化率很低，只有搭配合適的6-BA和NAA配比才能有效促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)和分化。結(jié)果表明，在基本培養(yǎng)基上添加2種激素的最佳組配濃度為0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA時(shí)，誘導(dǎo)效果與其他處理間差異明顯。表3不同激素組合對(duì)幼嫩莖段誘導(dǎo)不定芽的影響

激素（mg/L）6-BANAA蜜柚沙田柚紅心柚玉環(huán)柚出芽率（%）總芽數(shù)（個(gè)）出芽率（%）總芽數(shù)（個(gè)）出芽率（%）總芽數(shù)（個(gè)）出芽率（%）總芽數(shù)（個(gè)）00.24.1d24.8d13.5d03.1d100.537.5bc3931.5bc2228.1bc3035.5bc3001.047.5b3847.5b3436.5b4255.5b380.50.290.0a9892.5a12292.0a11191.0a1100.50.587.5a10977.5a12775.5a12976.0a740.51.042.5b6555.0b7557.0b7350.0b721.00.237.5bc4142.5bc4340.5bc4439.5bc421.00.530.0bc3435.0bc3333.5bc3534.0bc331.01.027.5bc2830.0bc3128.5bc3029.5bc32

2.3不同外植體的培養(yǎng)對(duì)不定芽發(fā)生的影響

通過(guò)對(duì)4個(gè)品種柚莖尖和莖段的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，研究對(duì)不定芽產(chǎn)生的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)前部分建立的柚最優(yōu)體系培養(yǎng)的研究結(jié)果看出，各種類柚均能有效誘導(dǎo)出芽，出芽率均在80%以上，誘導(dǎo)形成的芽叢生且生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)；不同外植體不同取材部位對(duì)誘導(dǎo)出芽率有較大影響，莖段最高的達(dá)950%，高于莖尖最高的87.5%，一般情況下，莖段可誘導(dǎo)形成3～4個(gè)叢生不定芽，莖尖則只有2～3個(gè)，有明顯的差距。

表4不同外植體對(duì)不定芽發(fā)生的影響

品種外植體

部位外植體

數(shù)量（個(gè)）形成芽出芽外植

體數(shù)（個(gè)）不定芽誘

導(dǎo)率（%）芽生長(zhǎng)

情況出芽所需

時(shí)間（d）沙田柚莖段403895.0a叢生20蜜柚莖段403485.0b叢生24紅心柚莖段403690.0a叢生23玉環(huán)柚莖段403485.0b叢生22沙田柚莖尖403587.5ab叢生15蜜柚莖尖403280.0c叢生17紅心柚莖尖403485.0b叢生18玉環(huán)柚莖尖403382.5bc叢生16

3結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)柚種子萌發(fā)條件、培養(yǎng)基激素組合以及不同外植體誘導(dǎo)的對(duì)比，研究貢水白柚組織培養(yǎng)各環(huán)節(jié)的主要影響調(diào)控因子，以期建立有效貢水白柚組織培養(yǎng)快速繁殖體系。結(jié)果表明，柚種子發(fā)苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)后，再轉(zhuǎn)至固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)為宜；在激素配比中，最適合貢水白柚幼嫩莖段的6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度以0.2 mg/L為佳；不同外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)率表明，春梢嫩莖段組織培養(yǎng)時(shí)出芽率高，生長(zhǎng)迅速，可能與春梢外植體內(nèi)含大量促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂的激素和其他某些促進(jìn)生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)物質(zhì)有關(guān)。

相同品種不同取材部位外植體的再生能力不同，各品種柚莖段直接出芽能力均高于莖尖。相關(guān)研究表明，最初來(lái)自根段的莖尖外植體發(fā)生側(cè)枝的數(shù)量和發(fā)生根的數(shù)量、長(zhǎng)度、干質(zhì)量及鮮質(zhì)量都高于來(lái)自莖段的莖外植體和側(cè)芽外植體[6-7]。本試驗(yàn)對(duì)柚莖段、莖尖外植體直接出芽能力作了分析，結(jié)果表明，2份品種均以莖段直接出芽能力最高，有利于快速繁殖和培養(yǎng)，從遠(yuǎn)離基部的表面誘導(dǎo)出芽苗的數(shù)目較多。

在離體繁殖時(shí)，多年生木本植物選擇外植體的取材時(shí)期非常重要。耿文娟等研究表明，野生歐洲李組織培養(yǎng)時(shí)以5～6月的半年生枝梢為材料效果最好[8]。本研究中進(jìn)行組織培養(yǎng)的柚外植體主要取自發(fā)育成熟的春梢和部分早秋梢，時(shí)間因物候期稍有差異，本試驗(yàn)結(jié)果基本與前人研究結(jié)果一致?？赡芘c新梢自身的發(fā)育狀況有關(guān)，也可能與新梢發(fā)育過(guò)程中隨季節(jié)變化體內(nèi)內(nèi)源激素種類、含量的變化有關(guān)。

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