1株侵染互花米草海洋真菌Buergenerula spartinae YDC07的分離鑒定

陳輝輝　金磊磊　喻鎮(zhèn)東　等

摘要：對侵染中國江蘇沿海灘涂鹽堿地的互花米草莖和葉上真菌進行分離純化，得到1株與侵染互花米草海洋真菌形態(tài)極其相似的菌株YDC07。對菌株YDC07進行培養(yǎng)性狀觀察和形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌與中國新記錄菌屬互花米草比爾格納菌十分相似；通過rRNA基因ITS序列分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌與比爾格納菌屬中互花米草比爾格納菌相似度為96%～99%，在進化樹中顯示親緣關(guān)系最近；該真菌可以侵染互花米草秸稈，使其生物量逐漸減少。菌株YDC07 rRNA-ITS序列相關(guān)信息提交NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank登錄號為KJ459363。菌株YDC07是在江蘇沿海灘涂鹽堿地互花米草上新發(fā)現(xiàn)的一種比爾格納菌屬海洋真菌。

關(guān)鍵詞：互花米草；海洋真菌；Buergenerula spartinae；rRNA-ITS；進化分析

中圖分類號： Q949.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0342-05

收稿日期：2014-03-31

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30971898）。

作者簡介：陳輝輝（1988—），男，江蘇南京人，碩士，主要從事植物真菌及病毒研究。E-mail：huihui_chen2012@163.com。

通信作者：陳集雙，博士，教授，主要從事植物真菌、病毒、植物反應(yīng)器、秸稈資源化和產(chǎn)業(yè)化利用等研究。E-mail：biochenjs@njut.edu.cn?；セ撞?979年引入我國，在減緩風暴潮壓力、保護灘堤、促進圍墾、消除近海污染等方面[1]發(fā)揮著積極作用，具有重要的生態(tài)價值，但因其耐受力和繁殖能力強等特性，導(dǎo)致其在與本土物種競爭、擠占貝類棲息地、改變?yōu)┩烤坝^、降低生物多樣性等方面[2]產(chǎn)生消極作用，互花米草已成為我國沿海主要的入侵物種[3]。Kohlmeyer等研究資料顯示，目前已經(jīng)報道來自互花米草的專性和兼性海洋真菌有39種[4-5]，這些海洋真菌具有很強的分解木質(zhì)纖維素和動植物尸體的能力[6-8]，具有潛在的應(yīng)用價值。不過，對互花米草中海洋真菌的長期研究發(fā)現(xiàn)，仍然有很多未知海洋真菌沒有被發(fā)現(xiàn)。研究表明，rRNA-ITS區(qū)在種內(nèi)非常保守，種間卻有較大變異。通常情況下，每種真菌的單倍體基因組rRNA拷貝數(shù)都會超過100個，可以很容易地從少量真菌組織中檢測到rRNA；ITS區(qū)在真菌的種或變種之間雖然相似性很高，但仍有足夠的種間序列差異，可以選擇一些序列作為?；砸颷9]。目前，rRNA-ITS區(qū)分子檢測是研究真菌菌種間同源性和遺傳關(guān)系，進行菌種鑒定的一種有效方法[10-12]。

試驗以江蘇沿海灘涂鹽堿地互花米草（Spartina alterniflora）植株的莖和葉為材料，對其進行海洋性真菌的分離純化，并通過形態(tài)學(xué)觀察及rRNA-ITS序列分析對菌株進行鑒定，為海洋性真菌的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試樣采集

互花米草莖和葉，于2012年10月9日采自江蘇省大豐市大豐港沿海灘涂鹽堿地。采集后的樣品分成2份，1份直接用于真菌分離，另1份于4 ℃冰箱短期保存，備用。

1.2試劑與儀器

主要試劑有：異丙醇、甲醇、氯仿、無水乙醇，均為分析純，市購；瓊脂粉、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等，市購；10 U/μL Taq DNA 聚合酶、脫氧核糖核苷酸（dNTPs），購自TaKaRa公司；DNA marker，F(xiàn)ermentas公司生產(chǎn)；DNA凝膠回收試劑盒，Axygen公司生產(chǎn)。主要儀器有：真空抽濾裝置，光學(xué)顯微鏡。

1.3真菌的分離與純化

真菌分離參照方中達的方法[13]進行，具體步驟為：把采集的互花米草葉和莖，浸泡在70%乙醇中10 s，無菌水反復(fù)漂洗3～5次；用有效氯含量34.0～46.0 g/L的NaClO溶液（巴氏消毒液），對互花米草葉和莖表面消毒3 min，用無菌水反復(fù)漂洗3～5次；將漂洗過的互花米草葉和莖用無菌濾紙吸去表面水分，移入PDA培養(yǎng)基平板中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)；當菌絲體產(chǎn)生時，切去邊緣菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基平板上純化；反復(fù)純化3代以上，得到純種真菌菌絲。PDA培養(yǎng)基配方為去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖或蔗糖18 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL；121 ℃滅菌20 min。

1.4形態(tài)學(xué)鑒定

1.4.1培養(yǎng)性狀觀察[14-17]將分離到的菌株YDC07接種于PDA平板中央，28 ℃靜置培養(yǎng)；在培養(yǎng)1、3、5、7、15、30 d后觀察、拍照、記錄菌落形狀、大小、色澤變化、表面菌絲和邊緣特征、菌落質(zhì)地及是否產(chǎn)生色素、是否產(chǎn)生孢子和產(chǎn)生孢子種類等。

1.4.2光學(xué)顯微特征觀察將載玻片洗凈擦干，中間添加1滴滅菌水；用解剖針挑取少量菌絲體置于水滴中，讓其充分散開；蓋上干凈的蓋玻片，置于顯微鏡下鏡檢觀察菌絲體粗細、分枝、是否有隔及是否產(chǎn)生分生孢子等特征。

1.5分子鑒定

1.5.1真菌基因組DNA提取將經(jīng)分離純化的真菌菌株YDC07的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3 d；通過真空抽濾裝置過濾收集菌絲體，冷凍干燥；經(jīng)液氮研磨，轉(zhuǎn)移至1 mL EP管中，采用改良SDS-CTAB法[18]提取基因組DNA，溶解于加有適量10 μg/mL RNaseA的ddH2O中；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。真菌基因組DNA提取液置于-20 ℃保存，備用。

1.5.2真菌ITS序列克隆以真菌菌株YDC07基因組DNA為模板，用White等設(shè)計的植物真菌通用引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′作為上下游引物[19]，進行ITS序列PCR擴增。擴增體系為50 μL：5 μL 10× PCR buffer，4 μL 25 mmol/L dNTP，1 μL 20 μmol/L ITS4，1 μL 20 μmol/L ITS5，1 μL模板DNA 50 ng，0.5 μL 10 U/L Taq聚合酶，37.5 μL ddH2O。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，參照使用說明書，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進行純化回收；經(jīng)純化回收的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α；在含Amp/IPTG/X-gal的LB 平板上，經(jīng)藍白斑篩選得到陽性白斑；通過堿法提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ單雙酶切鑒定及PCR擴增檢驗陽性克隆產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為陽性的質(zhì)粒送到南京金斯瑞公司進行DNA測序（ABI 3730xl DNA analyzer，Perkin-Elmer，USA）。endprint

1.5.3真菌rRNA-ITS序列系統(tǒng)進化分析測得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blastn相似性比對，下載同源性較高的序列，用ClustalX 1.83[20]軟件進行多級比對；利用Bioedit軟件手工將比對結(jié)果進行加工，去掉長序列的多余部分；用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[21]，進化樹由Bootstrap Test of Phylogeny中Neighbor-Joining（NJ）法制作完成。

1.6互花米草秸稈被真菌YDC07侵染后癥狀及其生物量變化

把曬干的互花米草秸稈高溫滅菌，稱量記錄秸稈的干質(zhì)量；接種針挑取一塊真菌菌絲放到PDA平板中央，沒有接種菌絲的PDA平板做為對照；將滅菌的互花米草秸稈在無菌條件下分別接種到有菌絲和沒有菌絲的PDA培養(yǎng)基四周，每天觀察記錄真菌對互花米草秸稈的侵染情況；接種7、14、30 d后取出平行的3組互花米草秸稈，去除菌絲并曬干，稱量記錄秸稈的干質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)性狀

由圖1可見，菌株YDC07菌絲在PDA培養(yǎng)基上前期生長速度較慢，后期較快，且為等徑生長，7～8 d即把直徑為 9 cm 的平板鋪滿；菌絲前期為白色透明狀，后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\褐色，最后轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚L到后期，菌絲開始老化變成深黑褐色；菌落形態(tài)為轉(zhuǎn)輪狀，中長細桿絨絲狀，層狀排列，大量時呈發(fā)絲狀堆積，邊緣整齊，邊緣一圓環(huán)狀菌絲與內(nèi)部圓形菌絲顏色稍有差別；培養(yǎng)3 d的氣生菌絲為白色，呈絨狀，基內(nèi)菌絲產(chǎn)少量灰褐色脂溶性色素，5 d左右氣生菌絲表面逐漸呈灰褐色，脂溶性色素顏色加深，7 d后培養(yǎng)基色素呈黑褐色，表面灰褐色菌絲逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?5 d時氣生菌絲全部變?yōu)楹诤稚?，脂溶性色素徹底轉(zhuǎn)變?yōu)樯詈诤稚?0 d左右菌絲開始成塊老化脫落。菌株YDC07菌落的生長特征與互花米草比爾格納菌（B. spartinae）及小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）特征[22]相吻合。

2.2光學(xué)顯微特征

由圖2可見，菌株YDC07菌絲體細長，交織成網(wǎng)狀，部分分枝與主枝成直角或銳角，菌絲有隔；隨著菌絲生長，菌絲逐漸變粗、變成熟，菌絲頂端會逐漸出現(xiàn)螺旋成團狀分布的分生孢子，孢子不斷變多、變大、成熟。菌株YDC07的菌絲特征與互花米草比爾格納菌及小麥全蝕病菌基本一致[22]。

2.3真菌rRNA-ITS序列進化分析

菌株YDC07基因組DNA的提取結(jié)果如圖3-A所示。rRNA基因ITS序列擴增引物ITS4和ITS5的擴增區(qū)段包括18 S和28 S的部分序列及ITS1、ITS2和5.8S的全部序列[23]，菌株YDC07基因組的擴增結(jié)果為598 bp（圖3-B）。

菌株YDC07基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast檢索，經(jīng)初步比對，提交序列與100條序列相似性很高，比對e值都為0。表1為列出的部分比對結(jié)果，由此可見，提交序列與來自于互花米草比爾格納菌種的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)段相似度為96%～99%、覆蓋率為89%～94%，其中，與Buergenerula spartinae strain SAP12、Buergenerula spartinae strain SAP124和Buergenerula spartinae strain SAP126的同源性最高，相似性為99%，其次是Buergenerula spartinae strain ATCC 22848，相似性為96%；提交序列與很多小麥全蝕病菌屬品種和幾株Magnaporthe salvinii品種、柱孢屬品種（Cylindrocarpon）的ITS1-5.8 S-ITS2區(qū)段序列相似度較高，同源性在89%～95%、覆蓋率在73%～97%。

由圖4可見，菌株YDC07與B.spartinae歸為1族。根據(jù)rRNA-ITS區(qū)序列同源性分析，菌株YDC07 rRNA-ITS序列與互花米草比爾格納菌品種同源性最高，結(jié)合該菌的培養(yǎng)性狀、光學(xué)顯微觀察結(jié)果，確定菌株YDC07為比爾格納屬真菌，是與該屬中互花米草比爾格納菌種極其相似的一種新記錄海洋真菌。

2.4互花米草秸稈被真菌YDC07侵染后癥狀及其生物量變化

由圖5可見，接種真菌YDC07的互花米草秸稈上有菌絲長出，而沒有接種真菌YDC07的互花米草秸稈則沒有。對接種前后互花米草生物量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，侵染真菌YDC07的互花米草秸稈干質(zhì)量，7、14、28 d后分別減少0.013 3、0.070 6、0.166 0 g，互花米草生物量逐漸減少。

3結(jié)論與討論

互花米草比爾格納菌是絲狀子囊菌中唯一一個可以直接通過顯微觀察確定菌株的歸屬，而不需要進一步通過對真菌rRNA-ITS區(qū)擴增進行ITS序列進化分析的菌株[5，24]。隨著分子鑒定方法的發(fā)展，先前許多根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征進行物種分類的方法受到質(zhì)疑，結(jié)合分子遺傳進化特征及形態(tài)學(xué)鑒定進行物種分類，是更科學(xué)、更準確的分類方法[25]。Schroeder等研究表明，真菌rRNA-ITS序列分析對解開絕大多數(shù)鹽沼地海洋真菌分類和進化關(guān)系之謎有著極其重要的作用[26-29]。Gessner等研究認為，互花米草比爾格納菌主要入侵互花米草的莖和葉[5]，這個入侵部位與本試驗結(jié)論較為一致。

通過對分離自江蘇沿海灘涂鹽堿地互花米草海洋真菌菌落的培養(yǎng)性狀觀察、菌絲光學(xué)顯微特征觀察及rRNA基因組ITS序列系統(tǒng)進化分析，確定分離得到的菌株YDC07和中國新記錄屬中比爾格納屬互花米草比爾格納菌（B. spartinae）成員特征相吻合， 因此，將其命名為B. spartinae YDC07。菌表1菌株YDC07基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對相似率較高的菌株

序列登錄號菌株名稱相似性endprint

（%）覆蓋率

（%）AF422960.1Buergenerula spartinae strain SAP129994AF422961.1Buergenerula spartinae

株YDC07是在江蘇省大豐市大豐港沿海灘涂鹽堿地的互花米草中分離得到的，與已報道的互花米草海洋真菌互花米草比爾格納菌生存環(huán)境一致，這也進一步證實YDC07真菌的分類歸屬是正確的。目前，菌株B. spartinae YDC07的菌絲中存在線粒體病毒，這是首次在江蘇大豐港沿海灘涂鹽堿地的入侵植物互花米草中發(fā)現(xiàn)攜帶線粒體病毒的海洋真菌，向NCBI提交真菌B. spartinae YDC07的rRNA-ITS序列及該真菌攜帶線粒體病毒的序列，獲得菌株B. spartinae YDC07的GenBank登錄號為KJ485703。另外，試驗表明，如B. spartinae YDC07侵染互花米草秸稈，則互花米草秸稈的生物量會逐漸減少。

本試驗研究一方面豐富了入侵江蘇沿海灘涂鹽堿地互花米草的海洋真菌種類，另一方面對NCBI數(shù)據(jù)庫中關(guān)于沿海灘涂互花米草的入侵海洋真菌及其攜帶病毒數(shù)據(jù)進行了補充。

參考文獻：

[1]Wang G，Qin P，Wan S W，et al. Ecological control and integral utilization of Spartina alterniflora[J]. Ecological Engineering，2008，32（3）：249-255.

[2]Simenstad C，Thom R. Spartina alterniflora（smooth cordgrass）as an invasive halophyte in Pacific northwest estuaries[J]. Hortus Northwest，1995，6（12）：38-40.

[3]李富榮，陳俊勤，陳沐榮，等. 互花米草防治研究進展[J]. 生態(tài)環(huán)境，2007，16（6）：1795-1800.

[4]Kohlmeyer J，Volkmann-Kohlmeyer B. Fungi on Juncus and Spartina：new marine species of Anthostomella，with a list of marine fungi known on Spartina[J]. Mycological Research，2002，106（3）：365-374.

[5]Gessner R V. Seasonal occurrence and distribution of fungi associated with Spartina alterniflora from a Rhode Island estuary[J]. Mycologia，1977，69（3）：477-491.

[6]Bergbauer M，Newell S Y. Contribution to lignocellulose degradation and DOC formation from a salt marsh macrophyte by the ascomycete Phaeosphaeria spartinicola[J]. FEMS Microbiology Ecology，1992，9（4）：341-347.

[7]Newell S Y，Porter D. Microbial secondary production from salt marsh-grass shoots，and its known and potential fates[J]. Kluwer Academic，2000，72：159-185.

[8]Newell S Y，Porter D，Lingle W L. Lignocellulolysis by ascomycetes （fungi） of a saltmarsh grass （smooth cordgrass）[J]. Microscopy Res Techn，1996，33：32-46.

[9]匡治州，許楊. 核糖體rDNA ITS序列在真菌學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 生命的化學(xué)，2004，24（2）：120-122.

[10]Aanen D K，Kuyper T W，Hoekstra R F. A widely distributed ITS polymorphism within a biological species of the ectomycorrhizal fungus Hebeloma velutipes[J]. Mycological Research，2001，105（3）：284-290.

[11]Hietala A M，Vahala J，Hantula J. Molecular evidence suggests that Ceratobasidium bicorne has an anamorph known as a conifer pathogen[J]. Mycological Research，2001，105（5）：555-562.

[12]Okabe I，Arakawa M，Matsumoto N. ITS polymorphism within a single strain of Sclerotium rolfsii[J]. Mycoscience，2001，42（1）：107-113.

[13]方中達. 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[14]劉崇玉. 植物內(nèi)生真菌HCCB05974和HCCB06030次級代謝產(chǎn)物的分離純化[D]. 上海：上海交通大學(xué)，2012.endprint

[15]楊宴霞. 放線菌SPRI-710055次級代謝產(chǎn)物中除草活性成分研究及菌種鑒定[D]. 上海：上海師范大學(xué)，2009.

[16]劉謙. 海洋放線菌TXC6-6次級代謝產(chǎn)物中活性組分的分離純化、結(jié)構(gòu)和菌種的鑒定[D]. 上海：上海師范大學(xué)，2012.

[17]劉巖巖，張鷺. 一株乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及菌種鑒定[J]. 齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報，2008，24（2）：21-24.

[18]Sambrook J，Russell D W. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

[19]劉春來，文景芝，楊明秀，等. rDNA-ITS在植物病原真菌分子檢測中的應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38（1）：101-106.

[20]Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J. CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucleic Acids Research，1994，22（22）：4673-4680.

[21]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[22]Walker J. Taxonomy of take-all fungi and related genera and species[J]. Biology and Control of Take-all，1981，29：15-74.

[23]趙杰. ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測中的應(yīng)用[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（4）：35-37.

[24]Newell S Y. Spore-expulsion rates and extents of blade occupation by ascomycetes of the smooth-cordgrass standing-decay system[J]. Botanica Marina，2001，44（3）：277-285.

[25]王春蘭，朱品，黃睿，等. 杭州地區(qū)一株侵染水稻的嗜水小核菌菌株的鑒定[J]. 科技通報，2013，29（9）：55-60.

[26]Schroeder S，Kim S H，Cheung W T，et al. Phylogenetic relationship of ophiostoma piliferum to other sapstain fungi based on the nuclear rRNA gene[J]. FEMS Microbiology Letters，2001，195（2）：163-167.

[27]O′donnell K. Ribosomal DNA internal transcribed spacers are highly divergent in the phytopathogenic ascomycete Fusarium sambucinum（Gibberella pulicaris）[J]. Current Genetics，1992，22（3）：213-220.

[28]de Los Angeles Vineusa M，Sanches-Puelles J M，Tibell L. Intraspecific variation in Mycocalicium subtile（Mycocaliciaceae） elucidated by morphology and the sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 region of rDNA[J]. Mycological Research，2001，105（3）：323-330.

[29]Yan Z H，Rogers S O，Wang C J K. Assessment of Phialophora species based on ribosomal DNA internal transcribed spacers and morphology[J]. Mycologia，1995，87（1）：72-83.劉波，謝清萍，李大軍，等. 基于高斯坐標平滑的界限溫度日期求算的新方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：347-350.endprint