全自動細(xì)胞分選儀對單細(xì)胞篩選的優(yōu)化與應(yīng)用

張 芳, 李麗莉, 楊怡姝, 李勁濤, 盛 望, 李澤琳, 曾 毅

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124)

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全自動細(xì)胞分選儀對單細(xì)胞篩選的優(yōu)化與應(yīng)用

張 芳, 李麗莉, 楊怡姝, 李勁濤, 盛 望, 李澤琳, 曾 毅

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124)

以Ec-109、BHK細(xì)胞為例，采用AVISO細(xì)胞分選儀進行單細(xì)胞的分選與優(yōu)化。首先，將電腦中的細(xì)胞篩選軟件與顯微鏡相連接，依據(jù)不同的細(xì)胞類型，設(shè)置合適的挑選參數(shù)，并從X、Y與Z軸層面精確校準(zhǔn)挑選位置。通過自由設(shè)定細(xì)胞特征參數(shù)，可準(zhǔn)確地挑選到目標(biāo)細(xì)胞。最后，檢測分析細(xì)胞篩選率，均可達到90%以上。該篩選技術(shù)對單細(xì)胞的挑選可提高到可視化水平，與常規(guī)篩選方法相比，樣品不需特殊處理，細(xì)胞收集方便，節(jié)約操作時間，提高了實驗效率。

全自動細(xì)胞分選儀； 細(xì)胞篩選； 特征參數(shù)

0 引 言

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，單細(xì)胞的研究逐漸受到關(guān)注。單細(xì)胞分析可以獲得反映細(xì)胞生理狀態(tài)和過程更準(zhǔn)確、更全面的信息，對于研究細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生理病理和重大疾病的早期診斷十分重要[1-3]。然而，單細(xì)胞提取數(shù)量少，分析困難大，常用的篩選方法有流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、高通量定向細(xì)胞篩選技術(shù)等[4-6]，但FCM篩選細(xì)胞需要數(shù)量多，篩選后僅獲得細(xì)胞群，而不是單一的細(xì)胞；常規(guī)的定向篩選是在96孔或384孔板中加抗生素，通過不斷的加壓篩選出有活性的細(xì)胞，該操作簡單，但工作量大、耗時長、容易產(chǎn)生假陽性[7-8]。因此，提高單細(xì)胞陽性篩選率勢在必行。

AVISO細(xì)胞分選儀是最新一代全自動單細(xì)胞分選、細(xì)胞群分離的自動化系統(tǒng)，能完整記錄細(xì)胞掃描及克隆挑選全過程，通過自由設(shè)定細(xì)胞特征參數(shù)(如形態(tài)學(xué)、熒光信號等)進行高通量單細(xì)胞篩選與分析。使用范圍廣，對貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞以及組織等多種樣品均可使用。陽性細(xì)胞獲取率高，樣本細(xì)胞不需要處理，方便快速，特別適用于低細(xì)胞數(shù)量的篩選。將細(xì)胞培養(yǎng)、收集提高到一種高分辨可視、選擇性控制的全新水平，在細(xì)胞生物學(xué)、再生醫(yī)藥研發(fā)研究領(lǐng)域處于領(lǐng)先優(yōu)勢[9-11]。本文對AVISO細(xì)胞分選儀功能與應(yīng)用進行了探究，描述了系統(tǒng)分選細(xì)胞的整個過程，并以轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(EmGFP)的食管癌Ec-109細(xì)胞與感染痘苗病毒的BHK細(xì)胞為研究對象，觀察不同種細(xì)胞分選后單細(xì)胞陽性獲取率及細(xì)胞存活率。

1 實驗材料與儀器

(1) 材料。Ec-109細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR203 vector)、BHK細(xì)胞(轉(zhuǎn)染EmGFP，感染痘苗病毒)，75%乙醇(國藥集團，北京)，PBS、1640培養(yǎng)基、DMEM購自Gibico公司，6孔板與96孔板分別購于NEST公司，EXPRESS SYBR?GreenERTMmiRNA qRT-PCR 檢測試劑盒(Invitrogen，USA)。

(2) 儀器。AVISO細(xì)胞分選儀 (德國Greiz-Gommla公司)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞挑選程序的設(shè)置

首先從CellCelector細(xì)胞挑選模塊中選取直徑為

50 μm的玻璃毛細(xì)管作為挑選工具，將待選細(xì)胞板、目標(biāo)板、PBS、75%乙醇分別放在固定位置(見圖1)。雙擊打開Cellcelector software軟件，將儀器與電腦軟件相連，彈出運行程序?qū)υ捒?，選擇“Init Device”進行初始化設(shè)備。檢測毛細(xì)管和管道是否存在氣泡，如果有大的氣泡，點擊“Program”中的“System liquid manager”按程序手動點擊“Next”通直到氣泡被排除。點擊“Configure decktray”、“Heating”、“Cell types”設(shè)置目標(biāo)板及收集細(xì)胞孔的位置、加熱器的溫度(37 ℃)、細(xì)胞類型等相關(guān)參數(shù)(見圖2)。點擊“Sterilize”，機械臂自動將挑選細(xì)胞的玻璃毛細(xì)管置于75%乙醇中消毒5 s，可反復(fù)操作多次。

1-倒置顯微鏡，2-自動化載物臺，3-CCDS顯微鏡，4-自動機械臂，5-一次性槍頭，6-目標(biāo)板圖1 AVISO全自動細(xì)胞分選儀

2.2 細(xì)胞挑選位置的校準(zhǔn)

挑選位置的校準(zhǔn)對于單細(xì)胞或細(xì)胞克隆團的精確挑選至關(guān)重要。首先進入“Program”，點擊“Calibrate Pickup Position”，從X軸、Y軸與Z軸三層面進行準(zhǔn)確緩慢校準(zhǔn)，調(diào)整合適的參數(shù)直至毛細(xì)管與電腦界面設(shè)置的中心位置相對稱(見圖3)，綠色的“Plate base not touched”轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的“Plate base touched”即表示毛細(xì)管已接觸到細(xì)胞板底面，再繼續(xù)點擊Z軸的“↑”，“Next”，“End”鍵直至機械臂自動歸位。

圖2 AVISO細(xì)胞分選儀相關(guān)參數(shù)設(shè)置界面

2.3 細(xì)胞挑選

細(xì)胞類型不同，挑選參數(shù)的設(shè)置也不同。最佳參數(shù)的優(yōu)化對于細(xì)胞的成功挑選至關(guān)重要。Ec-109細(xì)胞為食管癌細(xì)胞，具有較強的貼壁能力，在挑選參數(shù)設(shè)置時可增加吸取速度值到45，但挑選為單個細(xì)胞，因此吸液量設(shè)置較低為0.1 μm，每次吸入細(xì)胞數(shù)設(shè)置為

圖3 AVISO細(xì)胞分選儀挑選位置校準(zhǔn)參數(shù)界面及其校準(zhǔn)圖

1個(見圖4)。而BHK細(xì)胞盡管為貼壁細(xì)胞，但感染痘苗病毒后，貼附能力降低，因此在挑選參數(shù)設(shè)置時降低吸取值優(yōu)化至25，由于吸取細(xì)胞團感染病毒且成簇，因此將吸液量設(shè)置為0.3 μm。

圖4 細(xì)胞類型與挑選參數(shù)設(shè)置表

在儀器的使用過程中，用戶可以自由設(shè)定細(xì)胞特征參數(shù)(如形態(tài)學(xué)、熒光信號等)。相機根據(jù)參數(shù)要求自動掃描培養(yǎng)皿的設(shè)定區(qū)域，檢測到目的細(xì)胞并將位置數(shù)據(jù)自動傳到軟件。實驗中，因篩選細(xì)胞均轉(zhuǎn)染EmGFP基因，以綠色熒光信號為特征參數(shù)。開啟熒光燈界面，選擇2通道，即GFP綠色通道，選擇所需要細(xì)胞克隆，點擊“Pick selected particle”， 并能連續(xù)選取細(xì)胞在“Add Particle from live image” (見圖5、6)。

圖5 細(xì)胞挑選設(shè)置參數(shù)

圖6 細(xì)胞挑選添加菜單

2.4 實驗結(jié)果

Ec-109細(xì)胞轉(zhuǎn)染了既表達miR-203又能表達EmGFP的質(zhì)粒。挑選中，以綠色熒光蛋白為特征參數(shù)，選取熒光強度高的單個細(xì)胞，以15個單細(xì)胞為一組，機械臂自動將挑選好的細(xì)胞按設(shè)定位置放入96孔板中。之后置37 °C孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶壁時觀察熒光感染率達到90%以上，細(xì)胞活性高，提取RNA，檢測miR-203的表達，表達溶解曲線圖如圖7所示。

圖7 Ec-109細(xì)胞挑選與miR-203的檢測結(jié)果

感染痘苗病毒的BHK細(xì)胞經(jīng)過第1次挑選后低溫破碎細(xì)胞，釋放病毒液并感染正常細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后病毒感染率在60%左右。將感染后的發(fā)綠色熒光細(xì)胞團二次挑選，再一次感染正常BHK細(xì)胞，細(xì)胞的感染率達到95%以上(見圖8)。

圖8 BHK細(xì)胞挑選與感染結(jié)果

3 結(jié) 語

AVISO全自動細(xì)胞分析分選系統(tǒng)CellCelector將細(xì)胞篩選提高到可視化的水平，與常規(guī)篩選方法相比，節(jié)約了操作時間，顯著提高了實驗效率。該系統(tǒng)除可全自動細(xì)胞分選外，還能進行細(xì)胞樣品處理與分析，是高通量細(xì)胞生物學(xué)分析最有效的研究平臺[12,13]。操作樣本不需要特殊處理，待分離的細(xì)胞可直接被吸入到50nl-12 μl液體培養(yǎng)基、基底膜或甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，細(xì)胞克隆或組織片段也可以被金屬刮取毛細(xì)管通過刮取移動模式從細(xì)胞群中成功分離，這對于玻璃載玻片上的組織切片和液體培養(yǎng)基中的克隆細(xì)胞尤為重要[14-15]。

此外，該系統(tǒng)收集細(xì)胞方便，收獲的細(xì)胞或組織材料可以被自動轉(zhuǎn)移到任何種類的培養(yǎng)器皿，像細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板、玻璃載玻片等。高精度細(xì)胞定位使單細(xì)胞微孔板鋪板，單細(xì)胞、或單細(xì)胞PCR制備變?yōu)榭赡?，為?xì)胞生物學(xué)的深入研究提供了有力的手段。

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Optimization and Application of Single Cell Screening by Automated Cell Selector

ZHANGFang,LILi-li,YANGYi-shu,LIJin-tao,SHENGWang,LIZe-lin,ZENGYi

(Department of Life Science and Bioengineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China)

A novel, facilitate and rapid high-throughput technology for cell directional selection was introduced. The operation processes of single cell selection and optimization were detailly described by using Ec-109 cells and BHK cells as examples. Firstly, the screening software in the computer was connected with microscope. The appropriate parameters of screening were setting according to the cell type, and the location of screening was calibrated from theXaxis,Yaxis andZaxis. The target cells were selected accurately through freely setting cell feature parameters. Finally, cell screening rates were detected and analyzed, and the results could reach above 90%. The new automated screening technology of single cell can be achieved to the visual level compared with the conventional screening method. The sample doses not need special treatment, and cells are collected conveniently. The new method saves the operating time, and improves the experiment efficiency significantly.

automated cell selector; cell screening; characteristic parameter

2014-07-29

國家科技重大專項(2014ZX10005002)；北京市教委科技面上項目(KM201510005027)；北京工業(yè)大學(xué)研究生課程建設(shè)項目(CR2013-B-015)

張 芳(1976-),女,山西晉中人,博士,助理研究員,主要從事于納米藥物分子抗腫瘤的研究。

Tel.:010-67392780;E-mail:zhangfang2000@bjut.edu.cn

G 633.91

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1006-7167(2015)05-0021-03