冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗制備及其對(duì)體液免疫的效果

田 文 裴銀輝 李 琳

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000)

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)簡(jiǎn)稱淋球菌(Gonococcus)，是引起淋病的病原菌，革蘭染色陰性，常成雙排列，無鞭毛、芽孢，有莢膜和菌毛，可攜帶多種質(zhì)粒。人類是淋球菌的自然宿主。淋病具有潛伏期短、傳染性強(qiáng)、社會(huì)危害性大等特點(diǎn)，主要通過性生活傳播，也可通過污染的衣褲、床上用品、毛巾、浴盆、馬桶等間接傳播[1]。目前常用的抗生素治療雖然可以縮短淋球菌感染持續(xù)時(shí)間并減少其傳播，但近年來隨著淋球菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，抗生素治療淋病的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，迫切需要尋找有效預(yù)防措施，但目前尚無臨床應(yīng)用的淋病奈瑟菌疫苗。淋球菌在進(jìn)化過程中形成了一套逃避人體免疫系統(tǒng)的機(jī)制，制備淋球菌疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫預(yù)防較困難。盡管如此，人們?nèi)栽诓恍傅匮兄屏懿∧紊呙纭６嗄暌詠?，相關(guān)學(xué)者通過對(duì)淋球菌滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等的深入研究，不斷探索高效的疫苗靶位用于淋病的預(yù)防和控制，有力地推動(dòng)了淋病奈瑟菌疫苗的研究。A群腦膜炎球菌多糖疫苗已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，使全國(guó)流腦發(fā)病率持續(xù)下降，取得了明顯成績(jī)[2]。淋病奈瑟菌與腦膜炎球菌同屬奈瑟菌屬，具有許多共性，由此可設(shè)想淋病奈瑟菌多糖疫苗的制備具有可行性。本研究旨在通過制備淋球菌多糖抗原，將多糖抗原與完全弗氏佐劑乳化共同免疫家兔，評(píng)價(jià)其在動(dòng)物中的免疫效果，為制備淋球菌主動(dòng)免疫制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。CMCC29403 WⅡ/WⅢ血清型，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，通過革蘭染色鏡檢、氧化酶、觸酶和自溶試驗(yàn)等初步鑒定，符合淋球菌典型形態(tài)和生化特征。

1.1.2 主要試劑。0.5%甲醛生理鹽水;十六烷基三甲基溴化銨;2mol/L氯化鈣溶液;1/10飽和中性醋酸鈉溶液;冷酚;0.1mol/L氯化鈣溶液;75%乙醇;95%乙醇;無水乙醇;丙酮。

1.1.3 弗氏完全佐劑(自制)。成分:羊毛脂10g，液體石蠟45mL，卡介苗75mg/mL(每支卡介苗加1mL蒸餾水稀釋混勻)。方法:將羊毛脂和液體石蠟加溫(水浴)置研缽中，然后將卡介苗加入研缽，邊加邊研磨，研磨均勻，分裝小管，8磅高壓20min備用。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。體質(zhì)量約5kg的健康成年雄性家兔16只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，稱重編號(hào)后隨機(jī)分為低劑量免疫組和高劑量免疫組，每組8只。

1.2 多糖提取[3～6]

1.2.1 淋病奈瑟菌培養(yǎng)與擴(kuò)增。使用平板劃線法將淋球菌接種于巧克力培養(yǎng)基，37℃環(huán)境燭缸培養(yǎng)48h。

1.2.2 去核酸。收獲淋病奈瑟菌后以0.5%甲醛滅菌，4000r/min，離心15min，收集上清液，于上清液中滴入數(shù)滴十六烷基三甲基溴化銨。室溫下過夜，13000r/min，離心30min，收集沉淀物。沉淀物溶于2mol/L氯化鈣溶液，至終濃度為1mol/L，搖動(dòng)1h，充分解離多糖十六烷基三甲基溴化銨。加入75%乙醇至終濃度為25%(v/v)，過夜，16000r/min，離心15min去沉淀，收集上清液。

1.2.3 沉淀多糖。于上述上清液中加入冷卻乙醇至終濃度為80%(v/v)，充分振搖。沉淀多糖，16000r/min，離心30min，收集沉淀多糖，然后用無水乙醇及丙酮各洗滌2次，第1次13000r/min，離心5min;第2次16000r/min，離心30min。將沉淀物(多糖粗制品)保存在－20℃以下備用。

1.2.4 多糖的精制及鑒定。將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10～20mg/mL，然后將1倍體積多糖上清液加入2倍體積冷酚充分振搖，重復(fù)提取3次。然后16000r/min，離心10min，收集最上層澄清液體，重復(fù)3次并用0.1mol/L氯化鈣溶液透析。透析后離心，于上清液中加乙醇至最終濃度為75%～80%(v/v)。16000r/min，離心30min，收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗滌2次。用無熱原蒸餾水溶解沉淀多糖，以α－萘酚法鑒定。

1.3 免疫程序

1.3.1 免疫。初次免疫:用2mL注射器吸取經(jīng)FCA乳化的抗原1.0mL。同時(shí)在兔的肩胛部選4～6點(diǎn)進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注射約0.2mL。低劑量免疫組抗原的組成為多糖200μL加0.5mL FCA乳化;高劑量免疫組則用多糖500μL加0.5mL FCA乳化;第2次免疫:間隔14d后，于家兔大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射用FCA乳化的抗原1.0mL，多點(diǎn)注射;第3和第4次免疫:分別間隔7d后，注射方式及劑量同第2次免疫。

1.3.2 兔免疫血清效價(jià)測(cè)定。末次免疫后第7天，耳緣靜脈采血，分離血清，應(yīng)用絮狀沉淀試驗(yàn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)家兔血清中特異抗多糖抗體效價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將資料進(jìn)行變量變換，取幾何均數(shù)，應(yīng)用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組均數(shù)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 多糖鑒定 α－萘酚法結(jié)果表明，在多糖溶液與濃硫酸兩液面間出現(xiàn)紅紫色的環(huán)，表明獲得沉淀物為多糖。

2.2 低劑量免疫組與高劑量免疫組動(dòng)物血清中淋病奈瑟菌多糖抗體效價(jià)的測(cè)定 應(yīng)用完全弗氏佐劑以增強(qiáng)抗體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。經(jīng)過4次免疫，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康，肩胛部紅腫但未見炎癥，其血清中淋球菌多糖抗體效價(jià)見表1。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中淋球菌多糖抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中淋球菌多糖抗體效價(jià)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明低劑量多糖抗原與高劑量多糖抗原免疫效果一致。

3 討論

疫苗是能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體或激活免疫細(xì)胞，以抵御外來病毒、寄生蟲和細(xì)菌入侵的一類特殊的生物制品。目前人用細(xì)菌性疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗、多糖疫苗、多糖蛋白結(jié)合疫苗、基因工程蛋白疫苗和類毒素等[7]。人類缺乏對(duì)淋病奈瑟菌的先天免疫力，普遍存在易感性;并且感染淋病奈瑟菌后機(jī)體難以產(chǎn)生有效的特異性免疫，可反復(fù)感染。人們?cè)谌?xì)胞疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗的研究中發(fā)現(xiàn):全細(xì)胞疫苗接種次數(shù)多，不良反應(yīng)大，可能有回復(fù)毒力危險(xiǎn);亞單位疫苗部分抗原的免疫原性較弱;DNA疫苗存在一些安全性問題[8]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，淋球菌疫苗的研究將進(jìn)入新階段。本研究旨在通過制備淋病奈瑟菌多糖抗原，評(píng)價(jià)其在動(dòng)物中的免疫效果。

本實(shí)驗(yàn)采用燭缸法培養(yǎng)淋球菌，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)、致病性、傳染力均為最佳，是最適合研究的時(shí)期，因此在此期收獲淋球菌最為適宜。淋球菌在溫度低于30℃或高于38.5℃生長(zhǎng)停止，一般在35℃～37℃環(huán)境培養(yǎng)24～48h。培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)發(fā)生細(xì)菌自溶，菌體蛋白析出，增加精制難度。在提取多糖過程中使用了對(duì)多糖具有較強(qiáng)沉淀作用的十六烷基三甲基溴化銨，又利用氯化鈣不同的濃度解離多糖十六烷基三甲基溴化銨，同時(shí)氯化鈣在酒精中對(duì)核酸有助沉淀作用，進(jìn)一步去除核酸。沉淀多糖過程中運(yùn)用相似相溶的原理，利用丙酮反復(fù)多次將多糖中的脂肪抽提出來，并除去。精制多糖時(shí)，加入2倍體積冷酚的溶液中具備了適合的蛋白濃度，溶液變?nèi)闈帷?/p>

Anderson[9]證實(shí)了革蘭陰性菌外膜的脂多糖(內(nèi)毒素)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，因此，在制備淋病奈瑟菌多糖抗原時(shí)，不可避免地會(huì)被自身的脂多糖所污染。脂多糖的污染可導(dǎo)致莢膜多糖菌苗的毒性增加，故必須進(jìn)一步進(jìn)行去污染處理。去除脂多糖主要依賴長(zhǎng)時(shí)間的超速離心處理。本研究中采用25000r/min，離心18h，脂多糖即可與莢膜多糖分離而沉淀，從而達(dá)到去除脂多糖的目的[10～13]。

家兔產(chǎn)生有效抗體的過程有一定的時(shí)間規(guī)律，通常，B細(xì)胞對(duì)抗原的初次抗體應(yīng)答潛伏期在10d左右，再經(jīng)10d左右抗體產(chǎn)生才達(dá)到峰值，但產(chǎn)生的抗體水平不高，親和力不強(qiáng)，抗體以IgM為主，因此不能形成對(duì)機(jī)體長(zhǎng)期有效的保護(hù)，但形成了記憶淋巴細(xì)胞[14]。而再次抗體應(yīng)答中由于抗原刺激的是記憶細(xì)胞，抗體產(chǎn)生的潛伏期只有2～3d，再經(jīng)3～5d抗體即達(dá)到峰值，產(chǎn)生高效價(jià)、高親和力、體內(nèi)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的以IgG為主的抗體，能有效保護(hù)機(jī)體不受病原體感染。通常會(huì)依據(jù)這一規(guī)律采用間隔2周以上的多次免疫程序。抗血清效價(jià)一般在免疫后4～6周為最高。在注入抗原的同時(shí)加入了FCA是為了增強(qiáng)抗體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。同時(shí)，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用冷酚法提取淋病奈瑟菌多糖抗原，并借助弗氏完全佐劑共同免疫家兔。根據(jù)抗原免疫劑量，分為低劑量組和高劑量組，評(píng)價(jià)低劑量和高劑量抗原體液免疫效果的差別，為進(jìn)一步疫苗應(yīng)用中劑量選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究結(jié)果表明，低劑量免疫組和高劑量免疫組的抗體效價(jià)分別為(1:381±0.004)和(1:269±0.008)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間抗血清的效價(jià)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，使用低劑量的多糖抗原可達(dá)到與高劑量抗原相同的免疫效果。因此，淋病奈瑟菌多糖可以作為淋病奈瑟菌主動(dòng)免疫制劑候選成分抗原。

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