人參總皂苷促進再生障礙性貧血小鼠造血及其機制探討*

尹利明， 鄭智茵， 沃立科， 王 瀟， 趙燕娜， 高瑞蘭

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州 310006)

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人參總皂苷促進再生障礙性貧血小鼠造血及其機制探討*

尹利明， 鄭智茵， 沃立科， 王 瀟， 趙燕娜， 高瑞蘭△

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州 310006)

目的： 觀察人參總皂苷(TSPG)對免疫介導(dǎo)型再生障礙性貧血(再障)小鼠的療效及其相關(guān)作用機制。方法: BALB/c小鼠經(jīng)亞致死劑量照射后輸入DBA/2小鼠淋巴細胞，制成再障小鼠模型。實驗分6組，正常小鼠組，模型組，TSPG低、中和高劑量治療組，環(huán)孢菌素A(CsA)陽性對照組，灌胃給藥15 d。觀察外周血象，檢測血清Th1/Th2/Th17因子含量、骨髓造血祖細胞集落生成率及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)的磷酸化水平。結(jié)果: TSPG治療再障小鼠的療效顯著，中、高劑量組的血紅蛋白含量、白細胞和血小板計數(shù)均明顯高于模型組；紅、粒和巨核系造血祖細胞集落生成率均明顯高于模型組。同時，顯著上調(diào)骨髓細胞磷酸化ERK1/2蛋白表達，降低血清Th1和Th17因子含量，并升高Th2因子含量。結(jié)論: 人參總皂苷有效地治療再障小鼠，具有一定程度的促進造血和調(diào)節(jié)免疫的功效，其作用機制可能是調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17因子的表達及ERK1/2的磷酸化。

人參總皂苷； 再生障礙性貧血； 造血； 免疫調(diào)節(jié)

我們的前期實驗研究證明自行提取分離的人參總皂苷(total saponins ofPanaxginseng，TSPG)具有促進造血的類生長因子樣效應(yīng)，由此研制成的升血靈膠囊，1999年被浙江省衛(wèi)生廳批準為醫(yī)院制劑。該膠囊臨床應(yīng)用15年，治療多種血細胞減少患者6 000余例，療效良好而無明顯副反應(yīng)。其對慢性再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA；簡稱再障)的有效率為69.7%[1]，聯(lián)合環(huán)孢菌素A(cyclosporine A，CsA)治療再障的有效率達83.3%[2]。前期實驗研究和臨床療效表明，TSPG具有促進骨髓造血祖細胞增殖[3-4]和調(diào)節(jié)免疫[5]的功效，但其作用機制尚未明確。本文采用免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型，觀察TSPG對再障小鼠的療效，并探討其相關(guān)的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和藥物

BALB/c小鼠，18～22 g，雌雄各半，60只，用于復(fù)制再障動物模型；DBA/2小鼠，18～22 g，雌雄不限，5只，作為免疫活性細胞的供體，均由浙江中醫(yī)藥大學動物中心提供。

TSPG干燥粉劑由浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥制劑中心提供，經(jīng)高效液相色譜法分析其純度大于86%，用生理鹽水配制成3、6和12 g/L的工作液。環(huán)孢菌素A由杭州中美華東制藥公司生產(chǎn)，用生理鹽水配制成2.5 g/L工作液。

2 方法

2.1 制備免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型 按照本研究所建立的方法[6]，無菌取DBA/2小鼠胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝等處的淋巴結(jié)。置200目的不銹鋼過濾網(wǎng)上，輕輕搗碎研磨，生理鹽水沖洗，收集單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為5×109/L。BALB/c小鼠經(jīng)[60Co]γ射線(1.0 Gy，5 min)全身均勻照射后，于4 h內(nèi)按每只106的劑量自尾靜脈輸入供鼠的淋巴細胞。

2.2 TSPG治療后外周血象的檢測 實驗分6組，包括正常小鼠、模型組、TSPG低、中和高劑量治療組(30、60和120 mg·kg-1·d-1，劑量根據(jù)預(yù)實驗及臨床治療劑量折算)及環(huán)孢菌素A(50 mg·kg-1·d-1)陽性對照組，每組10只。灌胃給藥治療15 d后，ABX血細胞分析儀檢測外周血細胞數(shù)量。

2.3 流式微球陣列(cytometric bead array，CBA)法測定外周血Th1/Th2/Th17細胞因子含量 眼眶采血，凝固后分離出血清樣品。按照Th1/Th2/Th17細胞因子檢測試劑盒(BD)說明書操作，制備捕獲7種細胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-17A 、IL-4、IL-6和IL-10的微球混合液，分別與標準品、樣品結(jié)合反應(yīng)，標準品和樣品均做3復(fù)管，室溫孵育2 h。洗滌1次，重懸后上機分析。所獲數(shù)據(jù)用BD CBA分析軟件自動繪制標準曲線，將樣品數(shù)據(jù)與標準曲線擬合，樣品血清中細胞因子含量均在標準品的檢測范圍內(nèi)，并計算血清中7種細胞因子含量。

2.4 骨髓造血祖細胞半固體集落培養(yǎng) 無菌取小鼠股骨，沖出骨髓細胞，洗滌2次后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，接種到造血祖細胞培養(yǎng)體系。紅系祖細胞培養(yǎng)體系含30%胎牛血清，2×103U/L重組人促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)，10%植物血凝素-白細胞條件培養(yǎng)液，0.3%瓊脂；紅系集落形成單位(colony-forming unit-erythroid，CFU-E)和爆式紅系集落形成單位(burst forming unit-erythroid，BFU-E)集落分別培養(yǎng)3 d和7 d。粒-單核系祖細胞培養(yǎng)體系含30%胎牛血清，10 μg/L重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，0.3%瓊脂，培養(yǎng)7 d。巨核系祖細胞培養(yǎng)體系含30%胎牛血清、10 μg/L重組小鼠促血小板生成素(thromboietin，TPO)、10 μg/L 重組小鼠白細胞介素3(interleukin-3，IL-3)、10-5mol/L 2-巰基乙醇和0.3%瓊脂，培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)體系均加入青霉素和鏈霉素各1×105U/L，造血生長因子購自Peprotech。接種于24孔培養(yǎng)板，每孔2×105個細胞，各樣品均為3復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫箱中孵育。倒置顯微鏡下計數(shù)集落數(shù)的標準為CFU-E≥8個細胞，BFU-E≥40個細胞，粒-巨噬系集落形成單位(colony-forming units-granulocyte macrophage， CFU-GM)≥40個細胞，巨核系集落形成單位(colony-forming unit-megakaryocyte， CFU-MK)≥4個細胞。

2.5 Western blotting分析骨髓有核細胞ERK蛋白表達及磷酸化水平 制備骨髓單細胞懸液，裂解紅細胞，離心棄上清。按照本研究所已報道的方法[7]采用細胞裂解液(含50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將40 μg蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液20 μL中，煮沸后，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到NC膜(Amersham)上，分別加特異性ERK1/2和p-ERK1/2抗體(CST)，室溫結(jié)合反應(yīng)1 h，加辣根過氧化物酶標記的 II 抗(Santa Cruz)，經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑(Amersham)作用1 min，采用灰度掃描系統(tǒng)測定并分析目的蛋白條帶。同樣實驗重復(fù)3次。

2.6 骨髓病理切片 取小鼠雙側(cè)下肢骨，置于苦味酸-多聚甲醛固定液中固定，稀鹽酸中脫鈣4～6 h后，進行脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色后觀察骨髓造血組織增生情況。

3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，藥物治療組與模型對照組比較，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 TSPG提高再障小鼠外周血細胞計數(shù)

模型小鼠外周血的血紅蛋白(hemoglobin, Hb)濃度、白細胞(white blood cell, WBC)和血小板(platelet, PLT)計數(shù)均明顯低于正常小鼠(P<0.01)。TSPG治療15 d后，低劑量起效，中、高劑量組血象3系顯著提高，以高劑量組升高最為明顯。Hb濃度、WBC和PLT計數(shù)在中、高劑量組均明顯高于模型組(P<0.05)。環(huán)孢菌素A治療后血象3系也有不同程度提高，但低于TSPG中、高劑量組(P<0.05)，見圖1。

2 TSPG調(diào)節(jié)再障小鼠血清Th1/Th2/Th17細胞因子的含量

用CBA法測定外周血Th1/Th2/Th17共7種細胞因子含量，其標準曲線的擬合指數(shù)(4-parameter logistic model)R2在99.58%～99.96%之間。再障小鼠血清INF-γ、TNF-α和IL-17A含量均明顯高于正常小鼠，而IL-4、IL-6和IL-10含量則低于正常小鼠(P<0.05)。TSPG治療能夠上調(diào)多種細胞因子含量，中劑量組的IL-2、TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-6和IL-10均有不同程度增加，其中IL-4、IL-6和IL-10含量升高的幅度又大于IL-2、TNF-α和INF-γ(P<0.01)，同時中劑量組IL-4、IL-6和IL-10的含量高于環(huán)孢菌素A治療組(P<0.05)。此外，TSPG高劑量組抑制Th1細胞因子INF-γ的分泌，促進Th2細胞因子IL-4、IL-6和IL-10的分泌(P<0.05)。環(huán)孢菌素A治療后INF-γ的含量顯著低于模型組和TSPG治療組(P<0.01)，IL-4和IL-10的含量雖略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義，見表1、表2。

3 TSPG促進再障小鼠骨髓紅系、粒系和巨核系造血祖細胞增殖

模型組骨髓造血祖細胞CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK集落數(shù)(2×105有核細胞)均明顯低于正常組(P<0.05)。TSPG治療組顯著地促進造血祖細胞增殖，中劑量組CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK集落數(shù)均明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)；高劑量組促進增殖的作用更為明顯，集落數(shù)顯著高于模型組(P<0.05)。環(huán)孢菌素A組CFU-E、CFU-GM和CFU-MK數(shù)量也有一定程度的提高，但低于TSPG中、高劑量組，見圖2。

Figure 1.TSPG at different concentrations elevated the periphe-ral blood hemoglobin (Hb) concentration and cell counts in the AA mice.Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsAA group;#P<0.05vsTSPG 30 mg·kg-1·d-1group.

圖1 TSPG提高再障小鼠外周血血紅蛋白濃度和血細胞計數(shù)

4 TSPG改善再障小鼠的骨髓抑制，促進造血功能恢復(fù)

骨髓病理切片結(jié)果顯示，正常組小鼠骨髓造血組織結(jié)構(gòu)完整，增生活躍，造血細胞量豐富。再障模型小鼠造血組織淺染，出現(xiàn)大量空白區(qū)，被脂肪組織代替，造血細胞量顯著減少。TSPG各治療組不同程度改善再障的骨髓抑制，其中TSPG中、高劑量組的作用更為明顯，造血組織間結(jié)構(gòu)較緊密，空白區(qū)少，造血島著色均勻，造血細胞量較模型組豐富，出現(xiàn)造血組織結(jié)構(gòu)修復(fù)現(xiàn)象。此外，環(huán)孢菌素A組骨髓抑制也有所改善，但仍可見較多空白區(qū)和脂肪組織，見圖3。

表1 TSPG調(diào)節(jié)再障小鼠血清Th1/Th17細胞因子的含量

*P<0.05,**P<0.01vsAA group；#P<0.05，##P<0.01vsCsA group.

表2 TSPG調(diào)節(jié)再障小鼠血清Th2細胞因子含量

*P<0.05,**P<0.01vsAA group；#P<0.05，##P<0.01vsCSA group.

Figure 2.TSPG at different concentrations promoted the proliferation of hematopoietic progenitor cells.Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsAA group;#P<0.05,##P<0.01vsTSPG 30 mg·kg-1·d-1group.

圖2 TSPG促進再障小鼠骨髓造血祖細胞集落生成

5 TSPG上調(diào)骨髓有核細胞磷酸化ERK1/2蛋白的表達

再障小鼠骨髓細胞ERK1/2蛋白的表達及其磷酸化程度均低于正常組，且p-ERK1/2蛋白表達的降低更為明顯(P<0.01)。TSPG低、中和高劑量組的p-ERK1/2蛋白表達均有不同程度增加，尤其是中和高劑量組接近正常組水平(P<0.01)。TSPG治療后ERK1/2蛋白表達水平略高于模型組，但無統(tǒng)計學差異。環(huán)孢菌素A組p-ERK1/2蛋白表達也高于模型組(P<0.05)，但低于TSPG中和高劑量組，見圖4。

Figure 3.TSPG improved myelosuppression status in the AA mice (×400).

圖3 各組小鼠骨髓病理切片觀察造血組織增生情況

Figure 4.TSPG up-regulated the protein level of phosphorylated ERK1/2. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsAA group;#P<0.05vsTSPG 30 mg·kg-1·d-1group.

圖4 TSPG上調(diào)再障小鼠骨髓有核細胞p-ERK1/2蛋白的表達

討 論

再障是常見的難治性血液病，屬于骨髓造血衰竭綜合征。常規(guī)用雄激素、免疫抑制劑如環(huán)孢菌素A、抗胸腺球蛋白/抗淋巴細胞球蛋白等西藥治療[8]，但療效尚不夠理想，且有諸多嚴重的毒副作用，如雄激素引起兒童性早熟和婦女的男性化、免疫功能低下等，免疫抑制劑的毒副反應(yīng)更為嚴重，肝腎毒性反應(yīng)，并可能誘發(fā)惡性腫瘤等，存在高花費和高風險的問題。因此尋找并研究安全有效治療再障中藥新藥很有必要。

本文自行提取分離TSPG研制成升血靈膠囊，作為院內(nèi)制劑臨床應(yīng)用15年，療效良好而無明顯副反應(yīng)。治療33例慢性再障的有效率達69.7%，基本治愈9例、緩解8例、進步6例和無效10例；血小板與血紅蛋白均明顯高于治療前[1]。聯(lián)合環(huán)孢菌素A治療30例慢性再障的有效率達到83.3%，基本治愈5例，緩解13例，明顯進步7例和無效5例[2]，提示聯(lián)合環(huán)孢菌素A可作為治療慢性再障的有效方法。

本文制備的免疫介導(dǎo)型再障小鼠模型，骨髓造血顯著抑制，外周血象顯著降低，伴Th1/Th2/Th17細胞因子異常，在病理方面與國內(nèi)報道的免疫介導(dǎo)再障模型具有類似的癥狀[9]，且與再障患者有類似的病理特點[10]。另外，鑒于人與小鼠壽命相差極大，小鼠壽命平均2.0～3.5年，人的壽命平均70歲，在研究用藥治療再障小鼠療程方面，本文采用人參總皂苷和環(huán)孢菌素A治療再障小鼠15 d，相當于治療患者10個月，大于其臨床起效療程。結(jié)果表明TSPG治療15 d能夠有效地改善再障的骨髓抑制，加快造血功能恢復(fù)，顯著升高外周血象，促進骨髓紅系、粒系和巨核系3個系列的造血祖細胞增殖。本研究小組前期體外實驗已證實TSPG能夠促進骨髓造血祖細胞增殖[3]，結(jié)合本文研究結(jié)果，提示TSPG具有促進再障造血的功效。

ERK1/2參與造血干/祖細胞增殖與分化[11-12]，磷酸化ERK1/2為其功能的活性狀態(tài)，磷酸化程度增加則促進造血干/祖細胞增殖。本文模型小鼠骨髓細胞p-ERK1/2表達水平顯著降低于正常小鼠，而TSPG治療組p-ERK1/2蛋白的表達上調(diào)，表明其磷酸化程度顯著增高，提示TSPG可能通過上調(diào)p-ERK1/2蛋白的磷酸化程度而促進造血干/祖細胞增殖與分化，至于ERK1/2蛋是否是TSPG的作用靶點，尚需進一步深入研究。

近年研究發(fā)現(xiàn)再障患者細胞免疫異常，表現(xiàn)為Th1/Th2比例失衡，伴有Th17細胞活性增強，并且Th1和Th17細胞因子對骨髓造血均有抑制作用[10, 13]。模型小鼠血清Th1細胞因子和IL-17含量明顯高于正常小鼠，而Th2細胞因子含量則低于正常小鼠，提示再障小鼠Th1細胞亢進，與臨床患者細胞免疫狀態(tài)相似。為了觀察TSPG免疫調(diào)節(jié)作用，本文采用再障臨床一線藥物免疫抑制劑環(huán)孢菌素A作為陽性對照藥，其能夠特異性抑制異?；罨疶細胞增殖，保護骨髓細胞遭受免疫損傷。結(jié)果顯示TSPG低、中劑量能夠提高Th2型細胞因子和部分Th1細胞因子的含量，高劑量TSPG抑制Th1細胞因子分泌，促進Th2細胞因子分泌，基本恢復(fù)Th1/Th2/Th17細胞因子比例平衡；陽性對照藥環(huán)孢菌素A顯著抑制Th1細胞分泌TNF-α和INF-γ，優(yōu)于TSPG，但增加骨髓造血祖細胞數(shù)量和改善外周血象的作用遠不如TSPG。因此，TSPG對骨髓造血祖細胞具有免疫保護和刺激增殖的雙重作用。此外，對于TSPG免疫調(diào)節(jié)機制的研究，我們將參考CBA的實驗結(jié)果，選擇對TSPG敏感的細胞因子為研究對象，其相關(guān)的免疫信號通路作為靶點，進一步深入研究人參總皂苷對免疫信號通路的調(diào)控作用。

本文結(jié)果結(jié)合以前的實驗和臨床研究，證明人參總皂苷具有促進造血和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，為其臨床應(yīng)用治療再障提供實驗依據(jù)。

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Total saponins ofPanaxginsengpromote hematopoiesis in mice with aplastic anemia

YIN Li-ming, ZHENG Zhi-yin, WO Li-ke, WANG Xiao, ZHAO Yan-na, GAO Rui-lan

(InstituteofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China.E-mail:gaoruilan@126.com)

AIM: To observe the effects of total saponins ofPanaxginseng(TSPG) on the promotion of hematopoiesis and to explore the underlying mechanism in treating aplastic anemia (AA) in a mouse model. METHODS: For preparation of AA model, BALB/c mice were exposed to sublethal dose of 5.0 Gy γ radiation, followed by transplantation of lymphocytes from DBA/2 donor mice. The experiment was divided into 6 groups, including normal control group, AA model group, TSPG treatment groups with low, medium and high doses, and positive control group with cyclosporine A (CsA). Both TSPG and CsA were administered by gastrogavage. After 15 d treatment, the peripheral hemogram was tested, the cytokine contents in serum were measured, and bone marrow semisolid culture of colony-forming assay was conducted for determining hematopoietic progenitor cells. The protein levels of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and its phosphorylation status in the bone marrow cells were determined. RESULTS: Curative effect of TSPG in treating AA mice was satisfactory. Peripheral counts of white blood cells and platelet, and concentration of hemoglobin in TSPG groups with medium and high doses were significantly higher than those in model control. TSPG increased the colony numbers of CFU-E, BFU-E, CFU-GM and CFU-MK derived from hematopoietic progenitor cells. Meanwhile, up-regulation of the phosphorylated ERK1/2, decreased contents of Th1 cytokines and increased contents of Th2 cytokines in the serum were observed. CONCLUSION: TSPG possess the dual efficacies on the promotion of hematopoiesis and immunoregulation in AA mice by regulating the expression of Th1/Th2/Th17 cytokines and increasing the phosphorylation of ERK1/2.

Total saponins ofPanaxginseng; Aplastic anemia; Hematopoiesis; Immunoregulation

1000- 4718(2015)04- 0732- 06

2014- 12- 04

2015- 03- 03

國家自然科學基金資助項目 (No. 81373876)；浙江省自然科學基金資助項目(No. Y207728; No. LY14H290003)；浙江省科技計劃項目(No. 2010C33098)

R556.5; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.028

△通訊作者 Tel: 0571-87071625； E-mail: gaoruilan@126.com