雷帕霉素對(duì)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)凋亡的影響*

尹樂樂， 蘇運(yùn)欽， 黃秀艷, 葉莎莎， 陳 真， 曾耀英△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心, 2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院組織移植與免疫研究中心，廣東 廣州 510632)

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雷帕霉素對(duì)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)凋亡的影響*

尹樂樂1,2▲， 蘇運(yùn)欽1▲， 黃秀艷2, 葉莎莎2， 陳 真2， 曾耀英2△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院組織移植與免疫研究中心，廣東 廣州 510632)

目的： 探討雷帕霉素(rapamycin, Rapa)對(duì)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞體外凋亡的影響。方法：無菌分離并體外培養(yǎng)C57BL/6J幼鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞。通過MTT比色法測定并分析Rapa濃度對(duì)幼鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞存活的影響； SYTOX? Green熒光染色聯(lián)合熒光酶標(biāo)儀檢測并分析Rapa對(duì)H2O2、ionomycin、deferorxamine等誘導(dǎo)劑作用一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞存活的影響；DiOC6(3)染色分析Rapa在H2O2氧化應(yīng)激損傷條件下對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢的影響；分別采用H2DCFDA和MitoSOXTMRed熒光染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測Rapa預(yù)適應(yīng)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS生成以及線粒體內(nèi)ROS含量的影響。結(jié)果：Rapa能促進(jìn)H2O2以及ionomycin聯(lián)合deferorxamine損傷作用下的星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活，對(duì)線粒體膜電勢有保護(hù)作用，可降低H2O2損傷作用下星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生并可以維持胞內(nèi)線粒體ROS的含量在較低水平。結(jié)論：Rapa能夠減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量并降低胞內(nèi)線粒體內(nèi)ROS水平；能夠減輕H2O2對(duì)細(xì)胞線粒體膜的損傷破壞，維護(hù)線粒體膜電勢的穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。

雷帕霉素； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

雷帕霉素(rapamycin, Rapa)作為臨床常見免疫抑制劑，除了用于器官移植以及自身免疫疾病治療外，亦能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬，具有抗腫瘤作用[1]。除此之外，Rapa在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面也有一定的保護(hù)作用，能夠顯著改善腦外傷引起的神經(jīng)功能障礙[2-3]，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞在低氧誘導(dǎo)下iNOS的表達(dá)[4]，對(duì)神經(jīng)退行性病變帕金森病[5]和阿爾茲海默病[6]具有神經(jīng)保護(hù)作用。目前，已有不少研究證實(shí)Rapa對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-9]，但從神經(jīng)支持細(xì)胞——星形膠質(zhì)細(xì)胞的角度觀察并研究Rapa對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的影響方面少見報(bào)導(dǎo)，且相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，在本研究中，我們選擇以星形膠質(zhì)細(xì)胞為對(duì)象，研究Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 主要材料

出生后0～24 h的清潔級(jí)C57BL/6J近交系小鼠，雄性，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

雷帕霉素購自Sigma，經(jīng)DMSO溶解并稀釋成2 mmol/L儲(chǔ)存液，分裝，-20 ℃保存。臨用前用無菌PBS稀釋成所需工作液濃度；除非另有說明，DMSO在培養(yǎng)體系中總的終濃度小于0.1%；噻唑藍(lán)(MTT)、雙氧水(H2O2)、脂多糖(LPS)、重組小鼠IFN-γ、谷氨酸(glutamate，Glu)、離子霉素(ionomycin，Ion)、2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol，2-ME)和L-谷氨酰胺(L-glutamine)均購自Sigma；DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液購于Gibco；胎牛血清、SYTOX? Green、2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)和MitoSOXTMRed reagent均購自Invitrogen；Griess reagent購自Promega；去鐵胺(deferoxamine，Def)購自Merck。

手術(shù)剪、眼科剪和眼科鑷購自中國蘇州手術(shù)器械廠；細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管、離心管、平皿和培養(yǎng)瓶均為Corning產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)為Becton Dickinson產(chǎn)品；熒光酶標(biāo)儀(LB941) 為Berthold產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(680型)為Bio-Rad產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng) 無菌條件下取出生后0～24 h的清潔級(jí)C57BL/6J小鼠的雙側(cè)大腦半球，置于5～10 mL DMEM/F12(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。去除嗅球、海馬、基底神經(jīng)節(jié)、腦膜，分離新大腦皮層，并剪碎為約1 mm3方塊。1 500 r/min離心5 min，并將所得細(xì)胞懸液分別以孔徑80、10 μm的尼龍膜過濾，去除血管、細(xì)胞團(tuán)塊和碎片。然后再接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿中，每60 mm培養(yǎng)皿接種細(xì)胞1×106個(gè)。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)3 d后，以含10%胎牛血清的DMEM/F12更換培養(yǎng)基，之后每周更換2次。在有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)2周之后，在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.25 mmol/L的二丁基環(huán)腺苷酸(dBcAMP)以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增長同時(shí)減少巨噬細(xì)胞的增殖。另外，將培養(yǎng)基換成neurobasal+2% B27的無血清培養(yǎng)基，以抑制成纖維細(xì)胞的增殖干擾，并使星形膠質(zhì)細(xì)胞達(dá)98%以上，且其形狀為星形。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，最終所獲的細(xì)胞中GFAP 陽性表達(dá)的細(xì)胞(即星形膠質(zhì)細(xì)胞)在85%以上， 而CD11b陽性細(xì)胞(即小膠質(zhì)細(xì)胞)在3%～5%之間,見圖1。

Figure 1.The image of purified astrocytes culturedinvitro(×100).

圖1 純化后體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞

2.2 MTT法檢測Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外細(xì)胞存活的影響 調(diào)整星形膠質(zhì)細(xì)胞密度為2×109/L， 加入96孔板，每孔180 μL。其分組如下：調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)、control組和Rapa各濃度組，且每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6～24 h使細(xì)胞貼壁。加入各濃度Rapa工作液10 μL使其終濃度分別為0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L 和1 μmol/L并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。小心吸去上清，加入90 μL 新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光度值并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中星形膠質(zhì)細(xì)胞的相對(duì)存活率。

2.3 SYTOX? Green聯(lián)合熒光酶標(biāo)儀檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡速率 調(diào)整星形膠質(zhì)細(xì)胞密度為5×108/L后采用96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～24 h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為control組、Ion組、Ion+Rapa組、H2O2組、H2O2+Rapa組、Ion+Def組以及Ion+Def+Rapa組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。且Rapa給藥組終濃度選擇為0.5 μmol/L。檢測前棄培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞上清，換加入含終濃度為1 μmol/L SYTOX? Green的Lock’s buffer(含Ca2+)45 μL，Ion+Def組和Ion+Def+Rapa組內(nèi)加入5 μL Def(終濃度為400 μmol/L)，檢測前棄培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞上清，換加入含終濃度為1 μmol/L SYTOX? Green的Lock’s buffer(含 Ca2+, 45 μL)。此外， Ion+Def組以及Ion+Def+Rapa組檢測前需加入Def(終濃度為400 μmol/L，5 μL)，然后立即上熒光酶標(biāo)儀檢測各組平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)且5 min檢測1次。其中激發(fā)光波長選擇488 nm，發(fā)射光波長選擇520 nm。本實(shí)驗(yàn)初始檢測10 min后，再次取出培養(yǎng)板，每孔另加入5 μL Ionomycin(終濃度為2.5 μmol/L)或H2O2(終濃度為500 μmol/L)再次上熒光酶標(biāo)儀檢測。平均每5 min檢測1次。最后統(tǒng)計(jì)各組的平均熒光強(qiáng)度。

2.4 DiOC6(3)檢測Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢的影響 利用熒光探針DiOC6(3)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢情況。Rapa同星形膠質(zhì)細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)上清液，再用板內(nèi)PBS清洗細(xì)胞后棄上清。然后每孔內(nèi)分別加入終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3)，置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光染色15 min。胰酶快速消化及PBS終止洗滌，1 500 r/min離心5 min后，最后加入200 μL PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 H2DCFDA熒光探針檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成量 利用熒光探針H2DCFDA檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生情況。Rapa同星形膠質(zhì)細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞上清液，細(xì)胞板內(nèi)用PBS清洗細(xì)胞后棄PBS。然后每孔內(nèi)分別加入H2DCFDA工作液(終濃度為10 μmol/L)置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光染色15 min。經(jīng)胰酶快速消化及PBS終止洗滌，1 500 r/min離心5 min后，最后加入200 μL PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 MitoSOXTMRed reagent檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體內(nèi)ROS的生成量 利用熒光探針MitoSOXTMRed reagent檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況。Rapa同星形膠質(zhì)細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)上清液，在細(xì)胞板內(nèi)用PBS洗滌細(xì)胞棄上清。然后每孔內(nèi)分別加入MitoSOXTMRed reagent(終濃度為5 μmol/L)，置37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光染色20 min。胰酶快速消化及PBS終止洗滌，1 500 r /min離心5 min后，加入200 μL PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較則采用one-way ANOVA 結(jié)合Student-Newman-Keulsq檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外細(xì)胞存活的影響

采用MTT法檢測Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活的影響，終濃度分別為0.125、0.25、0.5以及1 μmol/L Rapa同原代星形膠質(zhì)細(xì)胞共孵育24 h后所得細(xì)胞存活率分別為(86.15±4.24)%、 (83.34±4.10)%、(82.01±4.07)%以及(81.02±2.71)%，結(jié)果表明所選濃度Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活的毒性影響較小，見圖2。

Figure 2.Determination of cell survival rate using the MTT assay after the astrocytes co-cultured with various concentrations of rapamycin for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2 MTT法檢測不同濃度Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外細(xì)胞存活的影響

2 Rapa對(duì)Ion或H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡的影響

SYTOX? Green是一種綠色熒光染料，與DAPI染色的對(duì)象不同：它僅對(duì)有細(xì)胞膜損傷的非健康細(xì)胞(即死亡細(xì)胞或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞)染色，而對(duì)健康的活細(xì)胞不染色。根據(jù)其特性，我們采用SYTOX? Green聯(lián)合熒光酶標(biāo)儀快速檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度由此分析細(xì)胞死亡情況。與control相比，終濃度為2.5 μmol/L的Ion能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞快速死亡；而終濃度為0.5 μmol/L Rapa不能阻斷Ion誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡的作用。另外，終濃度為500 μmol/L的H2O2長時(shí)間作用星形膠質(zhì)細(xì)胞亦能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡，然而，Rapa(0.5 μmol/L)卻能夠降低H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡速率，見圖3。

Figure 3.The effects of Rapa on the cell death of astrocytes induced by Ion or H2O2. Mean±SD.n=3.

圖3 Rapa對(duì)Ion或H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡的影響

3 Rapa對(duì)Ion 聯(lián)合deferoxamine誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡的影響

Deferoxamine能加快Ion誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡速率，Rapa卻能夠長時(shí)間拮抗deferoxamine對(duì)細(xì)胞的作用，明顯降低deferoxamine聯(lián)合Ion誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡速率,見圖4。

Figure 4.The effects of Rapa on the cell death of astrocytes induced by Ion or Ion plus Def. Mean±SD.n=3.

圖4 Rapa對(duì)Ion 聯(lián)合Def誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡的影響

4 Rapa對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢的影響

DiOC6(3)作為一種親脂性熒光染料能夠與活細(xì)胞線粒體發(fā)生結(jié)合，其過程依賴于線粒體自身的膜電勢水平。而線粒體膜電勢的變化通常反映線粒體膜穩(wěn)定性的狀態(tài)，一旦線粒體膜穩(wěn)定性變差，即線粒體膜通透性增高致使細(xì)胞趨向發(fā)生凋亡。通常流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果中DiOC6(3)平均熒光強(qiáng)度左移往往是意味著細(xì)胞線粒體膜穩(wěn)定性變差，致使細(xì)胞易于發(fā)生細(xì)胞凋亡。所以,DiOC6(3)的平均熒光是否發(fā)生偏移的結(jié)果可以間接反映細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control組相比，單獨(dú)Rapa作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠增強(qiáng)其線粒體膜電勢(P<0.05)。終濃度為500 μmol/L的H2O2亦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢有降低作用，與control組相比較差異顯著(P<0.01)。各濃度Rapa在H2O2條件下亦能提高細(xì)胞線粒體膜電勢(P<0.01)，見圖5、6。

Figure 5.Flow cytometry analysis was used to determine the effects of Rapa on mitochondrial membrane potential in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖5 Rapa作用下對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢的影響

5 Rapa對(duì)H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

H2DCFDA作為一種活細(xì)胞染料，它在進(jìn)入活細(xì)胞膜內(nèi)能夠被細(xì)胞內(nèi)酯酶作用并轉(zhuǎn)化生成為H2DCF，而后者對(duì)細(xì)胞內(nèi)各類ROS敏感且極容易被其氧化并生成2’，7’-dichloroflurorescein產(chǎn)物。而氧化后產(chǎn)物具有強(qiáng)熒光特性，通常結(jié)合熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，根據(jù)平均熒光強(qiáng)度變化來表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平。由此，我們選擇H2DCFDA并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測Rapa預(yù)處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平的影響。其結(jié)果表明，H2O2組與control組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.01)。同時(shí)，在H2O2條件下，各濃度Rapa均可使細(xì)胞ROS處于較低水平(P<0.01),見圖7。

Figure 6.The effects of Rapa on mitochondrial membrane potential of astrocytes treated with H2O2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

圖6 Rapa對(duì)經(jīng)H2O2處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢的影響

Figure 7.The effects of Rapa on the production of ROS in the astrocytes induced by H2O2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

圖7 Rapa對(duì)H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS生成的影響

6 Rapa對(duì)H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

MitoSOXTMRed是一種新型高選擇性熒光探針，能夠快速高選擇性靶向結(jié)合活細(xì)胞內(nèi)線粒體。一旦進(jìn)入線粒體，MitoSOXTMRed能夠即刻被線粒體內(nèi)ROS氧化進(jìn)而表現(xiàn)為紅色熒光。通常結(jié)合熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平，可根據(jù)平均熒光強(qiáng)度變化來表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體ROS水平，各濃度Rapa單獨(dú)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)能降低細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平(P<0.01)。與control組相比，H2O2組內(nèi)線粒體內(nèi)ROS量降低。另外，在H2O2條件下，各濃度Rapa均可使細(xì)胞線粒體內(nèi)的ROS處于較低水平，但與H2O2組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖8。

Figure 8.The effects of Rapa on the mitochondrial production of ROS in the astrocytes induced by H2O2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖8 Rapa對(duì)H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS生成的影響

討 論

我們已在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rapa預(yù)適應(yīng)后對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷小鼠模型有保護(hù)作用[9]。因此，基于上述理論依據(jù)，我們在本實(shí)驗(yàn)研究中以星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，體外選擇性模擬離子失衡及氧化反應(yīng)等細(xì)胞微環(huán)境，從而進(jìn)行觀察Rapa在體外誘導(dǎo)凋亡作用下對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

我們首先在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)境中加入ionomycin和H2O2分別模擬不同條件下細(xì)胞內(nèi)Ca2+過載，觀察Rapa預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，Rapa未能抑制ionomycin直接誘導(dǎo)Ca2+超載引起的細(xì)胞死亡，但是卻能夠顯著降低H2O2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡速率。研究表明，在低濃度條件下，H2O2可介導(dǎo)氧化應(yīng)激作用破壞線粒體功能，減少細(xì)胞內(nèi)ATP生成量，并依次打開ATP依賴性通道和非特異性陽離子通道進(jìn)而導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流[10]。由此，我們推測Rapa可能通過影響上述通路進(jìn)而減緩氧化應(yīng)激刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞外攝取Ca2+速度，以及推遲細(xì)胞達(dá)到離子失衡狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)氧化應(yīng)激損傷作用下細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用。而有關(guān)Rapa對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP生成影響，以及其對(duì)ATP依賴性通道和非特異性陽離子通道的影響作用，還需要我們進(jìn)一步研究工作加以證實(shí)。

接著，我們選用Def進(jìn)一步模擬氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞損傷，繼續(xù)觀察Rapa對(duì)氧化應(yīng)激條件下誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響。Def是一種鐵依賴性自由基抑制劑。研究表明，Def能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強(qiáng)缺氧條件下PC12細(xì)胞內(nèi)鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)以及它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合活性[11]。有人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在一些神經(jīng)性疾病如帕金森病[12]、阿爾茲海默病[13]以及缺血性腦血管病[14]發(fā)生發(fā)展過程中可被視為起到關(guān)鍵作用。而體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對(duì)神經(jīng)損傷、缺血性腦血管病[15]等具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rapa能明顯降低Def聯(lián)合Ion誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡速率。結(jié)果提示，Rapa能夠抑制Def對(duì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用，從而間接降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+過載引起的細(xì)胞死亡。同時(shí)，這種保護(hù)機(jī)制與直接抑制Ca2+內(nèi)流無關(guān)，且有關(guān)Rapa對(duì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)信號(hào)途徑的影響還有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以研究。

腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中生成過量活性氧自由基，它們對(duì)線粒體內(nèi)膜造成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、使得線粒體膜流動(dòng)性降低、膜蛋白和脂類發(fā)生降解以及線粒體膜的通透性增高進(jìn)而影響了線粒體內(nèi)膜電勢，使得線粒體合成ATP的功能發(fā)生障礙。線粒體功能障礙又可導(dǎo)致氧自由基生成進(jìn)一步增多，同時(shí)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物酶相對(duì)不足而不能全部清除過量的ROS，又可引起生物膜上重要的脂類、蛋白等成分受到破壞，進(jìn)一步損傷線粒體功能，造成惡性循環(huán)，最終引起細(xì)胞發(fā)生凋亡?？傊?，氧化應(yīng)激已成為腦缺血介導(dǎo)神經(jīng)凋亡的重要因素之一。本研究中，我們通過檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電勢，從側(cè)面評(píng)價(jià)Rapa對(duì)氧化應(yīng)激損傷作用下細(xì)胞凋亡的影響。我們選擇DiOC6(3)作為細(xì)胞線粒體膜電勢表現(xiàn)的反應(yīng)。結(jié)果表明，單獨(dú)Rapa作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠增強(qiáng)其線粒體膜電勢；在H2O2氧化應(yīng)激損傷作用下Rapa亦能提高細(xì)胞線粒體膜電勢平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果提示Rapa具有維護(hù)線粒體膜電勢穩(wěn)定性作用，從而對(duì)氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

此外，我們進(jìn)一步選擇經(jīng)典氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑H2O2與星形膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)，借以模擬腦缺血再灌注過程中的氧化應(yīng)激損傷環(huán)境。我們選擇 H2DCFDA和MitoSOXTMRed分別檢測細(xì)胞和線粒體內(nèi)ROS生成量，以間接評(píng)估Rapa對(duì)線粒體功能的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)H2O2能夠誘導(dǎo)大量星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生死亡，使得細(xì)胞外膜以及線粒體膜穩(wěn)定性受損，膜通透性增加，進(jìn)而使得細(xì)胞在長期H2O2誘導(dǎo)作用下ROS的生成量“漏出”細(xì)胞膜或線粒體外，因而FCM結(jié)果顯示為H2O2組ROS量相對(duì)降低。然而，在Rapa預(yù)處理干預(yù)作用下，細(xì)胞在H2O2條件下存活程度變高，細(xì)胞膜和線粒體膜穩(wěn)定性均得到增強(qiáng)，故而該條件下FCM結(jié)果顯示各濃度Rapa預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平值均維持在較低水平。再聯(lián)合單獨(dú)Rapa作用靜息狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體ROS水平結(jié)果，整體說明了Rapa能夠有效降低星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。我們推測，Rapa可能參與影響了線粒體呼吸鏈過程的某個(gè)環(huán)節(jié)，進(jìn)而表現(xiàn)為降低細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的含量。另一方面，Ravikumar等[16]發(fā)現(xiàn)Rapa對(duì)體外誘導(dǎo)的PC12、NRK、COS-7、CSM-14和HeLa細(xì)胞系凋亡有抑制作用。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦支持上述論斷，但有關(guān)Rapa在H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中所參與的保護(hù)環(huán)節(jié)尚未清楚，還需進(jìn)一步工作加以證實(shí)。

綜上所述，Rapa可減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量，降低胞內(nèi)線粒體內(nèi)ROS水平，減輕H2O2對(duì)細(xì)胞線粒體膜的損傷破壞，并維護(hù)線粒體膜電勢的穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。但有關(guān)Rapa在H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中所參與的作用途徑和機(jī)制極為復(fù)雜，還有待我們進(jìn)一步工作加以研究。

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Effect of rapamycin on apoptosis of mouse astrocytesinvitro

YIN Le-le1, 2, SU Yun-qin1, HUANG Xiu-yan2, YE Sha-sha2, CHEN Zhen2, ZENG Yao-ying2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospital，2InstituteofTissueTransplantationandImmunology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzengyy@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of rapamycin on the apoptosis of mouse astrocytesinvitro. ME-THODS: The astrocytes from C57BL/6J newborn mouse pups were isolated and primarily cultured. The effect of rapamycin on the viability of astrocytes was assessed by MTT assay. The mean fluorescence intensity of SYTOX? Green stain in the astrocytes was detected by fluorescence microplate reader in order to analyze the effects of rapamycin on the cell death induced by H2O2, ionomycin and/or deferorxamin. DiOC6(3) staining was used to analyze the mitochondrial membrane potential of the astrocytes induced by H2O2. Flow cytometry analysis was used to determine the production of ROS in the astrocytes and mitochondria by staining with H2DCFDA and MitoSOXTMRed reagent, respectively. RESULTS: Rapamycin at concentration of 0.5 μmol/L protected the astrocytes against cell death induced by H2O2or deferoxamine plus ionomycin. Rapamycin protected the mitochondrial membrane potential of astrocytes from the injury of H2O2. It also reduced the production of ROS in the astrocytes and decreased the level of ROS in the mitochondria. CONCLUSION: Rapamycin reduces the ROS overload in the mitochondria, keeps mitochondrial membrane potential safety and protects the astrocytes against apoptosisinvitro.

Rapamycin; Astrocyte; Apoptosis

1000- 4718(2015)04- 0652- 07

2014- 12 -10

2015- 01- 23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31200667)；暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金青年基金(理工醫(yī)類)資助項(xiàng)目(No.11614311)

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.014

△通訊作者 Tel： 020-85226219； E-mail： tzengyy@jnu.edu.cn

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