硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及PPARγ、NF-κB表達(dá)的影響*

肖 婷， 羅 健， 吳志雄， 李 芳， 張晶晶， 楊 軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

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硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化及PPARγ、NF-κB表達(dá)的影響*

肖 婷， 羅 健， 吳志雄， 李 芳， 張晶晶， 楊 軍△

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的： 初步探討硫化氫(H2S)對(duì)糖尿病心肌纖維化的影響及其作用機(jī)制。方法: 采用鏈脲佐菌素(STZ)單次腹腔注射的方法制作大鼠糖尿病模型，以硫氫化鈉作為外源性H2S供體。將 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、STZ組、STZ+H2S組及H2S組，每組各10只。8周后處死大鼠，HE染色及VG染色觀察心肌膠原分布情況，并用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)。Western blotting 觀察大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、PPARγ和NF-κB的表達(dá)水平。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，STZ組大鼠心肌組織膠原纖維明顯增多，Ⅰ型膠原表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，PPARγ表達(dá)明顯減少(P<0.05)，NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與STZ組相比，STZ+H2S組心肌膠原纖維較少，Ⅰ型膠原表達(dá)明顯降低(P<0.05)，PPARγ表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而H2S組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、PPARγ以及和NF-κB蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均無顯著差異。結(jié)論: 硫化氫可改善糖尿病心肌纖維化，其內(nèi)在機(jī)制可能與PPARγ-NF-κB途徑有關(guān)。

硫化氫； 糖尿病心肌纖維化； Ⅰ型膠原； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ； 核因子κB

心肌纖維化是糖尿病所致心臟損害的重要特征，大量的膠原沉積于心肌間質(zhì)，從而影響心肌收縮及舒張功能，導(dǎo)致心功能不全，也與心律失常，甚至心源性猝死的發(fā)生密切相關(guān)。心肌纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，其中炎癥反應(yīng)常與心肌纖維化并存，炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，PPARγ已被證實(shí)在調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝和炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)也是調(diào)控機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步的研究表明，PPARγ對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用主要是通過抑制NF-κB的活化來完成的，PPARγ通過與其配體結(jié)合而被激活，可使NF-κB活性下降或抑制其活化，從而減少細(xì)胞因子的表達(dá)，最終緩解炎癥反應(yīng)[1]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是作為一種新型的氣體信號(hào)分子，參與心血管系統(tǒng)生理及病理過程的調(diào)節(jié)。它可通過擴(kuò)血管、抗氧化、抗凋亡等機(jī)制，在高血壓和心肌缺血再灌注等心血管疾病中發(fā)揮一定的心肌保護(hù)作用[2]。近來徐文明等[3]發(fā)現(xiàn)H2S 可通過抑制 NF-κB 通路保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗阿奇霉素引起的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞毒性。然而，硫化氫對(duì)糖尿病心肌纖維化的影響及其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，目前尚不清楚。

本研究通過觀察糖尿病大鼠心肌組織I型膠原、PPARγ及NF-κB表達(dá)情況，及硫化氫對(duì)其表達(dá)影響，初步探討硫化氫對(duì)糖尿病心肌纖維化的影響及其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品與試劑

40只雄性SD大鼠，體重250～300 g，由長(zhǎng)沙SJA實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于(23±1) ℃的環(huán)境中，白天黑夜各12 h；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均可自由獲得水和食物。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自MP Biomedicals；硫氫化鈉(H2S供體)購(gòu)自Sigma；兔源Ⅰ型膠原、PPARγ及NF-κB I抗購(gòu)自武漢博士德公司；鼠源GAPDH I抗購(gòu)自廣州晶欣生物科技有限公司；抗兔II抗和抗鼠II抗購(gòu)于武漢博士德公司；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司。

2 方法

2.1 模型建立及處理方案 將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由進(jìn)食、飲水。隨后，將大鼠隨機(jī)分4組：對(duì)照組(control組)、糖尿病組(STZ組)、糖尿病硫化氫干預(yù)組(STZ+H2S組)及硫化氫對(duì)照組(H2S組)，每組各10只。大鼠禁食12 h 后，糖尿病大鼠模型通過單次腹腔注射STZ(40 mg/kg，溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，pH 4.4)構(gòu)建，非糖尿病大鼠單次腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉。3 d后經(jīng)由尾靜脈取血，血糖高于16.7 mmol/L的大鼠視為糖尿病動(dòng)物造模成功，用于后續(xù)試驗(yàn)。STZ+H2S組和H2S組大鼠每日腹腔注射硫氫化鈉(100 μmol/kg)，對(duì)照組和STZ組僅注射同等劑量的生理鹽水。第8周末，采用10%水合氯醛(350 mg/kg)行腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔，摘取心臟后用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，取適量組織于甲醛中固定后用于制作石蠟切片，剩余組織保存在-80 °C冰箱，用于免疫印跡測(cè)定蛋白等。

2.2 心肌組織病理學(xué)觀察 分別取4組大鼠左心室心肌組織，用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚4 μm, 行HE及VG染色，于光鏡下觀察攝片。采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)VG染色圖片進(jìn)行心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)分析，CVF=膠原面積/總面積。

2.3 Western blotting檢測(cè)心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白、PPARγ和NF-κB蛋白含量 取大鼠新鮮左心室組織，提取蛋白后進(jìn)行蛋白定量；以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5% BSA封閉2 h后，以Ⅰ型膠原、PPARγ、NF-κB和GAPDH I抗(稀釋度均為1∶400)37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜，TBST洗膜3 次，洗膜后用HRP標(biāo)記的II抗(稀釋度為1∶4 000)37 ℃孵育1 h，同樣用TBST洗膜3 次，ECL發(fā)光，曝光后掃描，以目的條帶和內(nèi)參照條帶GAPDH的灰度比值分別表示Ⅰ型膠原蛋白、PPARγ及NF-κB的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠心肌組織的HE染色結(jié)果

4組大鼠左心室心肌組織HE染色結(jié)果顯示STZ組大鼠心肌膠原纖維分布顯著增多，存在明顯心肌纖維化，而STZ+H2S組大鼠心肌纖維化較STZ組明顯改善，見圖1。

Figure 1.HE staining of myocardial tissues from the rats with different treatment (×200).

圖1 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

2 大鼠心肌組織VG染色結(jié)果

4組大鼠左心室心肌組織VG染色結(jié)果顯示STZ組大鼠心肌組織存在大量被染成紅色的膠原纖維，而STZ+H2S組大鼠心肌膠原纖維較STZ組明顯減少。膠原半定量分析結(jié)果顯示，STZ組 CVF 明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而STZ+H2S組CVF明顯低于STZ組(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.VG staining of myocardial tissues from the rats with different treatment (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group.

圖2 大鼠心肌組織VG 染色結(jié)果

3 4組大鼠心?、裥湍z原表達(dá)的比較

如圖3所示，與正常對(duì)照組比較，STZ組大鼠心肌組織中的Ⅰ型膠原表達(dá)水平明顯升高，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，STZ+H2S組大鼠心?、裥湍z原表達(dá)與STZ組大鼠組相比明顯下調(diào)(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，H2S組心?、裥湍z原表達(dá)無明顯差異。

Figure 3.The effect of hydrogen sulfide on collagen Ⅰ expression in the myocardial tissues of diabetic rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group.

圖3 硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌組織Ⅰ型膠原表達(dá)的影響

4 4組大鼠心肌組織中PPARγ和NF-κB蛋白的表達(dá)

如圖4所示，與正常對(duì)照組相比，STZ組大鼠組心肌組織PPARγ表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)，STZ+H2S組PPARγ較STZ組明顯上調(diào)(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，STZ大鼠組心肌組織NF-κB表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，STZ+H2S組NF-κB較STZ組明顯下調(diào)(P<0.05)。H2S組大鼠心肌PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組無明顯差異。

討 論

糖尿病心肌病是糖尿病嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥。心肌纖維化是糖尿病心肌病主要病理特征。有研究用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血清和心臟中多種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)升高[4]。依貝沙坦可通過下調(diào)促炎因子IL-1β表達(dá)，減輕心肌纖維化程度，從而緩解糖尿病導(dǎo)致的左心室功能障礙，進(jìn)一步提示炎癥與糖尿病心肌纖維化密切相關(guān)[5]。并且還有研究表明，通過減輕炎癥反應(yīng)可緩解高血壓心肌纖維化[6]。硫化氫是一種重要的細(xì)胞信號(hào)分子，被證實(shí)在高壓力負(fù)荷和心肌缺血再灌注等病理狀態(tài)下發(fā)揮一定的心肌保護(hù)作用。與此同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)氣體分子硫化氫在抑制炎癥方面具有重要的作用，并可能與其心肌保護(hù)作用有關(guān)。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)硫化氫可通過下調(diào)血管緊張素Ⅱ 1型受體表達(dá)抑制高血壓大鼠心肌重構(gòu)[7]，但關(guān)于此氣體信號(hào)分子對(duì)糖尿病大鼠心肌病變的影響及機(jī)制的報(bào)道目前尚為少見。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，腹腔注射鏈脲佐菌素后大鼠體重明顯下降，血糖顯著升高，說明糖尿病大鼠模型建立成功。HE染色、VG染色及Ⅰ型膠原Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠心肌組織膠原纖維明顯增多，而硫化氫干預(yù)后可使糖尿病大鼠心肌中膠原的表達(dá)降低，結(jié)果提示硫化氫可在一定程度上改善糖尿病導(dǎo)致的心肌纖維化。

Figure 4.The effects of hydrogen sulfide on PPARγ and NF-κB expression in the myocardial tissue of diabetic rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group.

圖4 硫化氫對(duì)糖尿病大鼠心肌組織PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

NF-κB存在于多種組織細(xì)胞中，多種參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子、黏附分子和蛋白酶類的基因轉(zhuǎn)錄過程均受其調(diào)控， 因此NF-κB與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。NF-κB被抑制后，轉(zhuǎn)錄過程受其調(diào)節(jié)的促炎因子、黏附分子等也會(huì)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB的表達(dá)，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB表達(dá)較正常大鼠明顯升高，而糖尿病硫化氫干預(yù)組NF-κB表達(dá)較糖尿病組下降，說明糖尿病心臟組織表達(dá)升高的NF-κB可能與糖尿病心肌纖維化發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而硫化氫在一定程度上可抑制NF-κB蛋白表達(dá)的上調(diào)，這也可能是硫化氫改善糖尿病導(dǎo)致的心肌纖維化的機(jī)制之一。

有學(xué)者認(rèn)為PPARγ-NF-κB途徑是調(diào)控炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要的靶點(diǎn)。PPARγ屬于核受體超家族成員,在組織中分布廣泛，PPARs有α、β/δ 和 γ 3 種亞型。而PPARγ與其配體結(jié)合而被激活后, 不僅能直接與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合發(fā)揮作用，還可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子(包括NF-κB)活性來發(fā)揮負(fù)向的間接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ和NF-κB在組織中經(jīng)常呈負(fù)相關(guān)表達(dá)，PPARγ具有明顯的免疫抑制和抗炎效應(yīng)。更值得關(guān)注的是，近年發(fā)現(xiàn)PPARγ參與多種器官纖維化的發(fā)生路徑,影響纖維化的進(jìn)程。如有研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮治療非酒精性脂肪性肝炎大鼠，使大鼠肝纖維化顯著改善[8]。本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病組大鼠心肌組織PPARγ表達(dá)下降，我們可推測(cè)，PPARγ蛋白表達(dá)下調(diào)可能參與了糖尿病大鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。而糖尿病硫化氫干預(yù)組大鼠心肌組織的PPARγ表達(dá)較糖尿病組大鼠明顯升高，因此，硫化氫可能通過上調(diào)PPARγ表達(dá)，通過PPARγ-NF-κB途徑減輕糖尿病心肌纖維化。

本研究提示硫化氫可能通過PPARγ-NF-κB途徑改善糖尿病心肌纖維化，結(jié)果可為糖尿病心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制研究，以及糖尿病心肌纖維化臨床治療提供了新的思路。

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Effect of hydrogen sulfide on myocardial fibrosis and PPARγ and NF-κB expression in rat model of diabetes

XIAO Ting, LUO Jian, WU Zhi-xiong, LI Fang, ZHANG Jing-jing, YANG Jun

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China.E-mail:yangjunincn@163.com)

AIM: To explore the effects of hydrogen sulfide (H2S) on the myocardial fibrosis in a rat model of diabetes and its mechanism. METHODS: Single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) was utilized to establish a rat model of diabetes. Sodium hydrosulfide was used as an exogenous donor of hydrogen sulfide. Male SD rats were randomly divided into control group, STZ group, STZ+H2S group and H2S group. Eight weeks later, HE and VG staining methods were used to observe the collagen distribution and collagen volume fraction was measured by image analysis. The expression levels of type I collagen, PPARγ and NF-κB in the cardiac tissues were determined by Western blotting. RESULTS: Compared with control group, collagen distribution and the expression levels of type I collagen and NF-κB in the cardiac tissues were markedly increased (P<0.05), while PPARγ was significantly decreased in STZ group (P<0.05), but these indexes were reversed significantly in STZ+H2S group (P<0.05). The expression levels of type I collagen, PPARγ and NF-κB had no significant difference between H2S group and control group. CONCLUSION: Hydrogen sulfide attenuates cardiac fibrosis in diabetic rats, and its mechanism may be related to PPARγ-NF-κB signaling pathway.

Hydrogen sulfide; Diabetic myocardial fibrosis; Type I collagen; Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2015)04- 0635- 05

2014- 11- 07

2014- 12- 08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81202830)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 11JJ2046)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.011

△通訊作者 Tel: 0734-8578767; E-mail： yangjunincn@163.com