中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在急性腎損傷中的保護(hù)作用

張雅麗，　崔麗艷，　張　捷

(北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191)

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在急性腎損傷中的保護(hù)作用

張雅麗，崔麗艷，張捷

(北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191)

摘要：急性腎損傷(AKI)在臨床上較為常見(jiàn)，且預(yù)后較差，需及早干預(yù)，但是目前臨床上常用的診斷方法主要依賴于功能性指標(biāo)，如血清肌酐(SCr)檢測(cè)。然而由于檢測(cè)技術(shù)的局限，SCr異常出現(xiàn)較晚，且其檢測(cè)結(jié)果亦有可能出現(xiàn)一定的偏差，這對(duì)于臨床上及時(shí)診斷及干預(yù)AKI非常不利。因此迫切需要一種能明確早期腎臟損傷的生物標(biāo)志物。近年來(lái)，許多學(xué)者在尋找早期AKI的生物學(xué)標(biāo)記物方面做了一定的探索，逐漸發(fā)現(xiàn)一些有潛在應(yīng)用價(jià)值的指標(biāo)，如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷分子-1(KIM-1)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)等，其中NGAL作為早期AKI生物標(biāo)志物的研究倍受關(guān)注。一些研究顯示NGAL在腎臟保護(hù)、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等方面亦發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制目前尚未完全闡明。文章僅就NGAL在AKI發(fā)生過(guò)程中所發(fā)揮的保護(hù)作用及其參與機(jī)制做相關(guān)綜述。

關(guān)鍵詞：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；急性腎損傷；凋亡；自噬

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)01-0080-05R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.020

Abstract:Acute kidney injury(AKI) is common in clinical practice， and the prognosis is so poor that needing early intervention， but now clinical diagnosis often depends on the functional indicators， such as serum creatinine (SCr) determination， however， due to the detection technology limitations， abnormal SCr appears much late， and the results may have some deviations， which is unfavorable about timely diagnosis and intervention of AKI， so it is urgent for a clear biomarker of early kidney damage. In recent years， scholars have been looking for the early biological markers of AKI， gradually finding some potentially useful indicators， such as neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)， kidney injury molecule-1(KIM-1)， interleukin 18(IL-18)， cystatin C(Cys C)， N-acetyl-beta-D-glucosaminidase(NAG)， liver fatty acid binding protein(L-FABP) and so on. NGAL as an early biomarker of AKI attracts much attention. Some studies show that NGAL also play an important role in protecting kidney inflammation and tumorigenesis, but the specific mechanism has not been fully understood yet. This review will discuss the protective role of NGAL in the occurrence of AKI and the related mechanisms.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271903)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BA137B01)

作者簡(jiǎn)介：張雅麗，女，1982年生，碩士，主治醫(yī)師，主要從事自噬在缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究。

通訊作者：張捷，聯(lián)系電話：010-82265751

收稿日期：(2014-05-05)

The protective effect of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in acute kidney injuryZHANGYali，CUILiyan，ZHANGJie.(DepartmentofClinicalLaboratory，PekingUniversityThirdHospital，Beijing100191，China)

Key words: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin; Acute kidney injury; Apoptosis; Autophage

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，既往稱為急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)，其發(fā)病率高，治療效果差。為進(jìn)一步改善ARF的預(yù)后，首先需要明確ARF的診斷標(biāo)準(zhǔn)。2005年，由國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)(International Society of Nephrology, ISN)、美國(guó)腎臟病學(xué)會(huì)(American Society of Nephrology, ASN)、美國(guó)腎臟病基金會(huì)(National Kidney Foundation, NKF)及急診醫(yī)學(xué)專業(yè)的全球?qū)＜夜餐M成的專家組，將ARF更名為AKI，其定義為由腎小球、腎小管、腎間質(zhì)或血管等病變引起的腎功能在短期內(nèi)急劇下降或喪失的臨床綜合征[1]。AKI的發(fā)生可涉及多個(gè)學(xué)科，如多器官功能不全、腎移植、心臟外科體外循環(huán)、感染、腫瘤、造影劑以及腎毒性藥物的應(yīng)用等。這些因素都是AKI常見(jiàn)的誘因。2012年，改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease Improving Global Outcomes，KDIGO)進(jìn)一步制定AKI指南，使其在診斷及治療方面均受到重視。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL) 屬于載脂蛋白超家族成員，在腎損傷早期出現(xiàn)即可出現(xiàn)升高。近年來(lái)，NGAL作為早期AKI的生物標(biāo)志物也逐漸得到認(rèn)可。研究表明NGAL可誘導(dǎo)大鼠的腎臟祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞、腎小管和完整的腎。腎小管細(xì)胞在受到刺激后，NGAL的產(chǎn)生和釋放均明顯增加，說(shuō)明NGAL對(duì)腎損傷起到一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能涉及鐵代謝、凋亡、自噬等多方面。

一、NGAL的結(jié)構(gòu)、分布及生物學(xué)功能

NGAL也被稱為人嗜中性脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NRL)、載脂蛋白-2、siderocalin、24p3或LCN2，屬于載脂蛋白超家族成員，相對(duì)分子質(zhì)量為25 000[2]，最初在活化的中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[3]。NGAL基因定位于人染色體9q34上，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)5 869 bp。NGAL蛋白由197個(gè)氨基酸組成的單肽鏈構(gòu)成，具有典型的β折疊桶狀構(gòu)象。NGAL借助β折疊桶封閉端的游離巰基C87與一些蛋白質(zhì)分子形成分子間二硫鍵，并由此調(diào)節(jié)這些蛋白的功能或活性[4]。此外，NGAL能與基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo proteinase 9，MMP-9)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而防止其自動(dòng)降解。

FRIEDL等[5]研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下NGAL可在機(jī)體內(nèi)多種正常組織中表達(dá)，如支氣管上皮細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、近端腎小管上皮細(xì)胞等，但在某些良性疾病和惡性腫瘤中則呈異常高表達(dá)。在腎臟中NGAL也呈異質(zhì)性表達(dá)，近端腎小管上皮細(xì)胞NGAL表達(dá)陽(yáng)性，而遠(yuǎn)端腎小管、腎小球和腎單位表達(dá)則為陰性。NGAL參與機(jī)體多種生物學(xué)過(guò)程，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥性免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等。在惡性腫瘤細(xì)胞中，NGAL在抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管生成(胰腺癌)及促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移等方面均發(fā)揮重要作用[6-8]。NGAL具有相對(duì)分子質(zhì)量小、自然分泌及相對(duì)穩(wěn)定的特性，因此有可能成為許多疾病診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物，包括炎癥和癌癥。

二、NGAL在腎臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

NGAL可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的分化和組織構(gòu)成。YANG等[9]研究誘發(fā)腎臟祖細(xì)胞分化的因素時(shí)，在輸尿管芽細(xì)胞系中分離得到了NGAL。NGAL作用于大鼠腎間質(zhì)細(xì)胞的周邊時(shí)(包括間質(zhì)細(xì)胞和早期上皮祖細(xì)胞)[10]，促進(jìn)并上調(diào)早期上皮祖細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)，引起間充質(zhì)祖細(xì)胞的上皮分化，同時(shí)產(chǎn)生腎小球、腎小管近端、循環(huán)亨勒及遠(yuǎn)端腎小管[9]。提示NGAL作用于腎臟外周基質(zhì)，從而促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞分化。另外，在培養(yǎng)集合管細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，NGAL可表達(dá)于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)的下游并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的組織形成管狀結(jié)構(gòu)[11]。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，在腎臟生長(zhǎng)過(guò)程中、發(fā)育異?；虺霈F(xiàn)退化及受到外界刺激時(shí)均可觀察到NGAL蛋白在腎小管上皮細(xì)胞中顯著表達(dá)，這與體外病理狀態(tài)下觀察的結(jié)果相一致[12-13]。但是，NGAL蛋白在體內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白上皮細(xì)胞譜系增長(zhǎng)和相關(guān)疾病中的作用仍有待進(jìn)一步明確。

三、NGAL發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制

NGAL在腎臟發(fā)育過(guò)程中(腎祖細(xì)胞轉(zhuǎn)換成腎小管上皮細(xì)胞和腎小管)起到關(guān)鍵性作用，并且在腎小管上皮細(xì)胞增殖過(guò)程中高表達(dá)。提示其對(duì)AKI損傷后的腎小管上皮細(xì)胞起保護(hù)或再生作用[9]。事實(shí)上，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，缺血再灌?ischemia-reperfusion，I/R)損傷之前或期間注入外源性NGAL均能在腎小管上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能方面提供顯著的保護(hù)作用。這可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡[14]相關(guān)。另外，NGAL可儲(chǔ)存多余的鐵，從而減輕由鐵介導(dǎo)的毒性作用，進(jìn)一步起到促進(jìn)再生和修復(fù)的作用。既往研究顯示，缺氧與復(fù)氧后HK-2細(xì)胞內(nèi)NGAL基因與蛋白水平顯著增加，說(shuō)明NGAL在I/R所造成的腎小管上皮細(xì)胞的損傷中起保護(hù)作用[15]。

1．NGAL與鐵代謝在過(guò)去的幾年中，鐵在AKI和慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的作用引起較多關(guān)注。當(dāng)腎小管細(xì)胞受損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鐵的水平可能會(huì)增加。其原因可能與鐵誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生有關(guān)。在腎臟疾病患者中，由于腎小球?qū)﹁F和含鐵的蛋白質(zhì)濾過(guò)增多，包括血紅蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和NGAL，導(dǎo)致腎小管暴露于高濃度的鐵中[16]。另外，GOETZ等[16]的研究結(jié)果顯示，載脂蛋白最重要的配體是鐵載體[siderophore(希臘語(yǔ)，意為攜帶鐵的蛋白)]，也稱鐵的內(nèi)源性配體，通過(guò)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和供應(yīng)參與細(xì)胞生長(zhǎng)和生存。三價(jià)鐵-鄰苯二酚配體利用鐵配位結(jié)構(gòu)選擇性結(jié)合NGAL[17]，從而發(fā)揮其鐵載體結(jié)合劑的作用，阻止鐵生產(chǎn)有害的氧自由基[18]。在有氧條件下，亞鐵離子與氧反應(yīng)產(chǎn)生三價(jià)鐵離子，而鐵載體可以溶解和封閉螯合鐵(主要為三價(jià)鐵)，這樣它通過(guò)合適的轉(zhuǎn)運(yùn)分子進(jìn)入質(zhì)膜內(nèi)[19]。與鐵載體/鐵相關(guān)的NGAL(siderophore/iron-associated NGAL)可提供鐵進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)鐵的釋放和胞內(nèi)積累，從而導(dǎo)致鐵依賴的基因調(diào)節(jié)[9]。鐵載體/無(wú)鐵的NGAL(siderophore/iron-free NGAL)捕獲細(xì)胞內(nèi)的鐵，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的鐵載體將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外[20]。另外，輸注外源性NGAL可以預(yù)防缺血性AKI[14]。對(duì)于AKI而言，減少腎臟中過(guò)多的細(xì)胞內(nèi)鐵的含量可能會(huì)是一種頗有前途的治療方法。

2．NGAL與細(xì)胞受體在探討NGAL信號(hào)如何作用其靶細(xì)胞的研究中，有兩種具有不同分子結(jié)構(gòu)的細(xì)胞表面受體被確定。一種受體稱為24p3/NGAL細(xì)胞表面受體(cell-surface receptor of 24p3/NGAL，24p3R/NGALR)，從小鼠FL5.12細(xì)胞中分離得到。24p3R/NGALR是一種蛋白質(zhì)分子，推測(cè)有12個(gè)跨膜螺旋的膜相關(guān)蛋白質(zhì)。24p3R/NGALR在HeLa細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，可誘導(dǎo)結(jié)合、攝取NGAL，從而出現(xiàn)特定的生物反應(yīng)。但是其在NGAL靶細(xì)胞中的特異性表達(dá)方面仍有待確定[20]。另一種NGAL受體分子顯示出巨蛋白受體的特征。巨蛋白在腎近端小管細(xì)胞中表達(dá)，被認(rèn)為是NGAL的靶細(xì)胞?？咕薜鞍卓贵w可阻止巨蛋白與NGAL高親和力結(jié)合[21]。但是，巨蛋白在遠(yuǎn)端小管對(duì)NGAL的攝取及在24p3R發(fā)揮作用過(guò)程中參與的程度尚不清楚。

3．NGAL與凋亡有研究證實(shí)，凋亡與I/R損傷造成的腎小管細(xì)胞受損相關(guān)[22-23]。MISHRA等[14]的研究結(jié)果顯示，注入外源性NGAL對(duì)腎小管細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有保護(hù)作用，提示可能是細(xì)胞凋亡減少的結(jié)果。在動(dòng)物體內(nèi)注入外源性NGAL進(jìn)行預(yù)處理后，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal dexynucleotidyl transferase，TdT))介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示與對(duì)照組(生理鹽水預(yù)處理)相比，凋亡率明顯減少。在缺血性損傷后注入NGAL，結(jié)果顯示與對(duì)照組(生理鹽水處理)相比有凋亡減弱的現(xiàn)象。然而，這種對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是不完整的。因?yàn)榕c非缺血性組相比，NGAL預(yù)處理或缺血后處理的動(dòng)物仍然表現(xiàn)出一定程度的凋亡，但是仍能起到一定的保護(hù)作用。有研究者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示外源性NGAL注入可抑制caspase-3活化，降低Bax表達(dá)，從而減少腎小管細(xì)胞凋亡。說(shuō)明NGAL對(duì)大鼠缺血再灌注損傷腎小管上皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其作用可能與減少細(xì)胞凋亡、改變凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)[24]。既往研究顯示[15]，缺氧與復(fù)氧后HK-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，加入NGAL后，早期凋亡率較單純?nèi)毖跖c復(fù)氧組下降，提示NGAL在HK-2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中發(fā)揮抗凋亡作用。對(duì)凋亡相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，加入NGAL可使HK-2細(xì)胞內(nèi)bax/bcl-2和caspase-3表達(dá)水平顯著下降。這表明NGAL是通過(guò)下調(diào)bax/bcl-2、caspase-3表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。

4.NGAL與自噬1975年，PFEIFER等[25]首次通過(guò)電子顯微鏡觀察到來(lái)自鼠腎臟的皮質(zhì)腎小管自噬泡。然而，自噬在腎小管細(xì)胞的作用直到近十余年才得到廣泛研究。I/R損傷是造成AKI的常見(jiàn)因素。I/R損傷后腎小管細(xì)胞中自噬激活，這在I/R損傷的細(xì)胞和動(dòng)物模型中已得到證明[26-33]，并且在移植的腎臟活檢標(biāo)本中亦可觀察到自噬增加[31]。關(guān)于自噬對(duì)I/R損傷的腎小管提供保護(hù)還是進(jìn)一步損傷存在不同說(shuō)法[34]。有些研究提出自噬在I/R損傷中的作用是不利的[35]。比如，將腎內(nèi)腺病毒Bcl-xL基因進(jìn)行內(nèi)部轉(zhuǎn)移或于Bcl-2/GFPLC3雙轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)表達(dá)Bcl-2以增強(qiáng)Bcl-xL基因的表達(dá)，均是通過(guò)抑制自噬和凋亡來(lái)保護(hù)I/R損傷后的腎小管上皮細(xì)胞[26, 28]。再灌注損傷和缺氧引起的短時(shí)間的缺血調(diào)節(jié)，可以同時(shí)減少自噬、凋亡及I/R誘導(dǎo)的腎小管損傷，并對(duì)I/R損傷的腎臟提供保護(hù)作用[33]。使用自噬抑制劑3-MA或ATG7 siRNA抑制自噬可顯著減少活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞死亡[31]。在長(zhǎng)時(shí)間缺血保存的腎臟中，使用巴弗洛霉素A1抑制自噬量同樣可以顯著減少細(xì)胞凋亡和caspase活性[32]。但是，JIANG等[29]證明，無(wú)論是用3-MA或Beclin1基因的siRNA還是ATG5 siRNA阻斷自噬都可以增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)，用3-MA或氯喹抑制細(xì)胞自噬可進(jìn)一步加重鼠腎臟的I/R損傷。近期他們還建立了一個(gè)腎小管特定自噬相關(guān)基因Atg7敲除的小鼠模型，這些基因敲除小鼠均明顯地表現(xiàn)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷更敏感，出現(xiàn)更嚴(yán)重的腎功能減退、組織損傷和細(xì)胞凋亡，說(shuō)明腎臟細(xì)胞自噬會(huì)減輕對(duì)腎臟的保護(hù)作用[36]。這些結(jié)果均支持自噬對(duì)I/R損傷提供保護(hù)機(jī)制。JIANG等[36]的研究結(jié)果顯示，近端小管中Atg5或Atg7基因缺失的小鼠與對(duì)照小鼠相比，自噬缺陷的小鼠表現(xiàn)出腎功能不全，血中尿素和肌酐水平顯著升高，p62蛋白和泛素陽(yáng)性胞漿內(nèi)包涵體蓄積，近端腎小管細(xì)胞凋亡增加。這表明自噬作用可去除有害蛋白質(zhì)聚集，保持腎小管動(dòng)態(tài)平衡，從而減輕I/R損傷造成的近端腎小管損傷。上述研究結(jié)果表明，自噬能保持近端小管細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)缺血性損傷有保護(hù)作用?？傊?，自噬與I/R損傷之間具有一定的關(guān)系，且NGAL對(duì)腎小管的保護(hù)作用亦有所證實(shí)，但是NGAL是否通過(guò)促進(jìn)自噬而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

四、NGAL的檢測(cè)方法

早期應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)NGAL表達(dá)，目前臨床上常用的檢測(cè)方法主要有以下3種：熒光免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及免疫化學(xué)發(fā)光法。熒光免疫層析法只能測(cè)定血液標(biāo)本，操作方便、檢測(cè)速度快，但只能獲得定性結(jié)果，不適于大量樣本測(cè)定。ELISA可同時(shí)檢測(cè)血液和尿液標(biāo)本，具有操作簡(jiǎn)便、定量及定性結(jié)果均可獲得的優(yōu)點(diǎn)，但不適于大量樣本的檢測(cè)。免疫化學(xué)發(fā)光法不能進(jìn)行血液標(biāo)本的測(cè)定，具有測(cè)定速度快、能獲得定量結(jié)果及批量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)臨床需要選擇合適的測(cè)定方法[37]。

五、問(wèn)題與展望

缺血性急性腎損傷在臨床上較為常見(jiàn)，并且預(yù)后極差，迫切需要新的預(yù)測(cè)及治療方法，有關(guān)AKI早期檢測(cè)的研究提出了許多生物標(biāo)志物，NGAL無(wú)疑是其中較有前途的生物標(biāo)記物之一。

當(dāng)然，我們尚需要更大規(guī)模的前瞻性研究確定如何聯(lián)合多個(gè)生物標(biāo)志物用于臨床檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)其與AKI的發(fā)病過(guò)程、嚴(yán)重程度和預(yù)后的相關(guān)性。NGAL是否在慢性腎疾病(例如常染色體顯性遺傳多囊腎病、腎小球腎炎、脈管炎)的病理、生理過(guò)程具有同樣重要的作用還有待進(jìn)一步研究。此外，NGAL具備預(yù)測(cè)急性、慢性腎功能衰竭患者預(yù)后的可能，甚至可以進(jìn)一步探討NGAL在AKI治療方面的應(yīng)用?？傊覀兛梢灶A(yù)期，NGAL在腎臟損傷的早期診斷及治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文編輯：龔曉霖)