霉菌毒素檢測方法的研究進展

張志美，付石軍，郭時金，宋道禎，霍 芳，沈志強*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600)

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霉菌毒素檢測方法的研究進展

張志美1,2，付石軍1，郭時金1,2，宋道禎1，霍 芳1，沈志強1,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600)

霉菌毒素廣泛分布于動物的各種飼料原料及飼料中。飼料被污染后，除了可引起飼料變質(zhì)外，還可導致動物的各種疾病，甚至引起急性中毒性死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害。論文就霉菌毒素對動物的危害及其在飼料和動物體內(nèi)的檢測方法進行歸納分析，為今后進一步健全霉菌毒素檢測方法，減輕霉菌毒素對養(yǎng)殖業(yè)的危害提供參考依據(jù)。

霉菌毒素；危害；檢測方法

霉菌毒素是霉菌次生代謝產(chǎn)物，毒性很強，廣泛分布于各種糧食和飼料原料中。當霉菌毒素通過各種途徑進入動物體，可引起動物免疫力降低、機能減退、發(fā)生疾病甚至死亡。霉菌毒素種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)對人和動物有毒性的有300多種，其中對人和動物危害較大的主要包括曲霉菌屬產(chǎn)生的黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)、雜色曲霉毒素等，鐮刀菌屬產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、T-2毒素等[1]。通過對飼料樣品進行抽樣檢驗，2013年，我國飼料中霉菌毒素的檢出率分別為：AFB175.9%，ZEN 91.6%，DON 88.4%、FB195.2%，T-2毒素80.6%[2]。

1 霉菌毒素對動物體的危害

高濃度霉菌毒素可導致動物的急性中毒甚至死亡，而長期飼喂含有低濃度霉菌毒素的飼料可引起動物體慢性中毒。其危害主要表現(xiàn)在以下四個方面：(1)破壞或降低飼料的營養(yǎng)成分，影響?zhàn)B分的吸收及代謝；(2)引起動物體肝臟、腎臟、肺臟、腸道等臟器損傷，如黃曲霉毒素的靶器官為肝臟，可引起肝硬化及肝癌等疾病，赭曲霉毒素A、桔青霉素、雜色曲霉毒素具有較強的腎臟毒性，可引起腎小管變性、壞死，導致患畜多尿、血尿及蛋白尿等；(3)引起各種繁殖障礙，導致母畜假發(fā)情、脫肛、流產(chǎn)、死胎等，如玉米赤霉烯酮具有較強的激素樣作用，可導致動物發(fā)情綜合癥；(4)造成動物體免疫抑制，誘發(fā)各類慢性疾病，降低飼料效益。

2 霉菌毒素的檢測方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)是一種利用抗體和抗原之間的專一性將其結合，對目標化合物進行檢測的方法，具有特異性強、靈敏度高、操作簡單，試驗過程中無需昂貴的試驗儀器等優(yōu)點。但是該方法所需抗原、抗體的制備需要較高的專業(yè)技術水平，且通常只能檢測一種物質(zhì)，因此，多被用于快速篩選檢查。目前，已有多種ELISA檢測試劑盒問世，主要包括AF、OTA、ZEN等。

2013年，黃曉琳等[3]采用ELISA試劑盒對肉雞肝臟、腎臟及糞便中的AFB1、OTA、ZEN進行分別檢測，AFB1、OTA的最低檢測限(Limit of Detection, LOD)為0.1 ng/g，ZEN達到1.0 ng/g。Liu等[4]利用ZEN的多克隆抗體進行間接競爭ELISA試驗檢測了玉米中ZEN的含量，檢測范圍為0.5～50.0 ng/mL。江濤等[5]建立了 OTA的間接競爭抑制ELISA檢測方法，在2～500 μg/L線性范圍內(nèi)，回收率為79%～119.7%，LOD可達0.5 ng/L。

2.2 膠體金免疫層析法

免疫層析法是20世紀80年代發(fā)展起來的一種將膠體金免疫技術和色譜層析技術相結合的固相膜免疫分析方法。其原理是將抗體固定在硝酸纖維素膜(Nitrocellulose filter membrane, NC膜)的特定區(qū)域，當NC膜的一端浸入樣品，在毛細管作用下，樣品向前游動，當移動到有抗體的地方時，抗原與抗體特異性結合，一些標記材料帶有顏色，所以結合的地方就會顯示出相應的顏色，從而達到免疫診斷的效果[6]。該方法操作簡單、檢測時間短，適合各類霉菌毒素的快速檢測。

Xiulan 等[7]在最適條件下，將AFB1的多克隆抗體與膠體金結合制成金標探針，用免疫層析法對AFB1 進行檢測，并將結果與ELISA 方法進行了比較，膠體金免疫層析法的LOD低至2.5 μg/L，為ELISA 的1/2；檢測時間可控制在10 min 內(nèi)，較ELISA 縮短了6～10 倍。徐振斌等[8]建立了膠體金免疫層析法快速定量檢測玉米中AFB1、B2、G1、G2總量的分析方法。LOD和最低定量限(Limit of Quantity, LOQ)分別為1.0 μg/kg和3.0 μg/kg，方法簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于玉米中上述四種黃曲霉毒素總量的快速定量檢測。鄧省亮等[6]建立了AFB1的膠體金免疫層析檢測方法，試紙條靈敏度可達5 μg/L，適合現(xiàn)場快速檢測。賴衛(wèi)華等[9]建立了OTA的膠體金試紙條快速檢測方法，LOD為10 μg/L，可在10 min內(nèi)完成檢測。另外，針對T-2毒素、嘔吐毒素、DON、AFB1等的膠體金試紙條/卡已研制成功，在霉菌毒素的快速檢測方面發(fā)揮了積極作用[10-13]。

2.3 薄層色譜法

薄層色譜法(Thin Layer Chromatography , TLC)檢測霉菌毒素，具有所用設備簡單、操作方便、分離速度快、顯色選擇性大等優(yōu)點。其原理是根據(jù)樣品理化性質(zhì)的不同，采用合適的溶劑對樣品中的霉菌毒素進行提取，通過薄層板展開分離，根據(jù)霉菌毒素的熒光性，利用熒光斑點的強弱大小進行半定量檢測。飼料中多種霉菌毒素的檢測標準均采用薄層色譜法，如配合飼料中DON的測定(GB/T8381.6-2005)、飼料中OTA的測定(GB/T19539-2004)、飼料中ZEN的測定(GB/T19540-2004)等[14]。其缺點是準確度較低，且重復性較差，僅適用于毒素的初步鑒定、小量純化及柱色譜條件的優(yōu)化篩選。

殷蔚申[15]采用TLC法對谷物中AF、T-2毒素及ZEN等14種霉菌毒素進行了同時檢測，其中黃曲霉毒素熒光吸收最強，LOD可達10.0 μg/kg。李海[16]對玉米、小麥等谷物中黃曲霉毒素、T-2毒素、雜色曲霉毒素等14種霉菌毒素進行了同時提取和薄層色譜分析，其中AFB1、B2、G1、G2等LOD最低，可達10.0 μg/kg，ZEN可達300～500 μg/kg，可用于谷物中霉菌毒素的初步檢查。

2.4 近紅外光譜法

近紅外光譜技術(Near Infrared Reflectance Spectroscopy Technique, NIRS)是20世紀90年代以來發(fā)展最快的光譜分析技術之一，是光譜測量技術與化學計量學的有機結合，具有分析速度快、準確度高、成本低、不破壞樣品、不需要試劑、樣品無需預處理等優(yōu)點，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、天體等領域應用廣泛[17]。

幾丁質(zhì)，又稱為甲殼素，是一種線型氨基多糖，廣泛存在于真菌細胞壁中，但不存在于高等植物中，且?guī)锥≠|(zhì)的濃度隨谷物中霉菌的增多而增加。根據(jù)以上性質(zhì)，有學者指出，可以利用幾丁質(zhì)來估測谷物等中霉菌毒素的污染程度。幾丁質(zhì)通過酸、堿或酶水解生成氨基葡萄糖，水解產(chǎn)物的測量方法有比色法、色譜法、顯微鏡法等。比色法和色譜法均需將樣品進行繁瑣的前處理；熒光染色法結合顯微鏡檢測則重復性較差，結果不理想。而NIRS法可以有效避免上述檢測方法的缺點，簡單快速，結果準確[18]。

2.5 氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜或以氣相色譜為基礎的氣質(zhì)聯(lián)用技術具有分離速度快、靈敏度高等優(yōu)點，但由于氣相色譜僅適用于揮發(fā)性較大同時熱穩(wěn)定性較高的物質(zhì)的分離檢測，因此，在實際應用中亦存在一定的缺點。主要用于鐮刀霉菌毒素及展青霉素等的檢測。

陳必芳等[19]建立了飼料中DON、T-2毒素、ZEN 3種鐮刀菌毒素的氣相色譜同時檢測方法，樣品經(jīng)提取、凈化、衍生后，用氣象色譜儀、毛細管柱、氫火焰檢測器(Flame Ionization Detector, FID)進行檢測，3種毒素分離度良好，LOD為50 μg /kg。林纓等[20]采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS-MS)法對玉米等糧食作物中的T-2與HT-2毒素進行檢測，二者在0.5～100 μg/kg范圍內(nèi)表現(xiàn)良好的線性關系，方法操作簡便、靈敏度高，適用于糧食樣品中T-2與HT-2毒素的檢測。溫肇霞等[21]對糧食中雪腐鐮刀菌烯醇、DON及新茄病鐮刀菌烯醇進行了檢測。樣品以甲醇水溶液進行提取、Florisil柱凈化、n-7氟丁酰咪唑衍生后進行氣相色譜檢測，方法簡單、快速，LOD可達10～100 μg/kg。2006年，梁穎等[22]建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同時測定飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的方法。飼料樣品經(jīng)Mycosep 227多功能凈化柱凈化后，硅烷化試劑衍生，HP-5 MS毛細管柱為色譜柱進行分離檢測。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇分別在10～1300 μg/L、8～1300 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，LOD分別為9 μg/kg、7 μg/kg，該方法檢測靈敏度高且具有良好的重現(xiàn)性。

2.6 液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

與ELISA、TLC、熒光光譜法等傳統(tǒng)檢測方法相比，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)法或在此基礎上發(fā)展起來的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)集液相色譜的高分離度和質(zhì)譜檢測器的通用性、可以提供分子結構信息、靈敏度高、選擇性好、前處理簡單等優(yōu)勢為一體，為多種霉菌毒素的同時快速檢測提供了新的方向[23]。

Jodlbauer等[24]建立LC-MS/MS測定牛、豬組織中ZEN的方法。樣品經(jīng)酶水解、RP-18柱固相萃取凈化后用質(zhì)譜測定，采用大氣壓化學電離方式，MRM模式下進行負離子檢測，豬和牛的檢測限分別為0.1 μg/kg和0.5 μg/kg。任一平等[25]采用超高壓液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(UPLC-MS/MS)對食品和飼料中包括曲霉菌類毒素、鐮刀菌類毒素、青霉菌類毒素在內(nèi)的17種霉菌毒素進行檢測，在ESI+電離方式下，10種霉菌毒素的LOQ范圍為0.01～0.20 μg/kg，均低于歐盟、美國等國家規(guī)定的最低限量；在ESI-電離方式下，7種霉菌毒素的LOQ范圍為0.2～0.5 μg/kg。應永飛等[26]采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS-MS)，在多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring, MRM)模式下建立了飼料中玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素及單端孢霉烯族A類毒素等14種霉菌毒素及其類似物的快速測定方法，樣品經(jīng)乙腈水溶液提取、正己烷脫脂、凈化柱凈化后進行檢測，LOD可達0.1～0.8 μg/kg。2012年，朱臻怡等[27]建立了花生及其制品中AFB1、B2、G1、G2、OTA、伏馬毒素B1、DON、T-2毒素、HT-2毒素及花生赤霉烯酮的LC-MS同時測定方法，各成分的LOD分別為：AFB10.5 ng/kg、AFB2、G1、G21ng/kg、OTA 與ZEN 2 ng/kg、T-2毒素與HT-2毒素10 ng/kg、伏馬毒素B120 ng/kg、DON 50 ng/kg，添加回收率均在72%以上。任貝貝[28]對黃曲霉毒素六種成分(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2)進行檢測，6種成分在7 min之內(nèi)可完全分離，且LOD為0.012～0.04 μg/kg；同時，建立了8 min內(nèi)同時測定不同谷類食品中8種霉菌毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、雜色曲霉毒素、ZEN、T-2毒素)的方法，LOD和LOQ分別為0.012～0.16 μg/kg和0.04～0.533 μg/kg，可用于谷物中上述霉菌毒素的檢測。韓鐫竹等[29]建立了牛奶中6種玉米赤霉烯酮類霉菌毒素(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮)的UPLC-MS殘留檢測方法，在6.68～8.33 min時間內(nèi)，8種物質(zhì)得到有效分離，且LOD可達1.0 μg/L。劉紅河等[30]建立了小麥、玉米等糧食中12種ZEN和DON等霉菌毒素的LC-MS-MS檢測方法。在多反應監(jiān)測(MRM)模式下，方法的檢出限低至0.04～0.18 μg/kg，加樣回收率均在90%以上，適用于測定糧食中ZEN和DON等霉菌毒素的快速定量檢測。

3 展 望

霉菌毒素種類多，對動物體危害嚴重，作為畜牧獸醫(yī)科技工作者，我們應把握重點，尤其是危害嚴重的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等，根據(jù)各自的生理生化特點，篩選快速有效的檢測方法，建立霉菌毒素的長效監(jiān)測機制，從而有效控制霉菌毒素，減輕其對家畜家禽的危害，從而保證養(yǎng)殖業(yè)的健康有序發(fā)展。

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Progress of Mycotoxin Hazard to Animal and its Detection Method

ZHANG Zhi-mei1,2,FU Shi-jun1,GUO Shi-jin1,2,SONG Dao-zhen1,HUO Fang1,SHEN Zhi-qiang1,2*

(1.BinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong256600,China;2.ShandongLvduAnteVeterinaryDrugCo.,Ltd.,Binzhou,Shandong256600,China)

Widely distributed in various feed ingredients and animal feed, mycotoxin contaminated and spoiled the feed, led to various disease to animal and even caused acute toxicity to death of animals and brought great loss to the breeding industry. The article deduced the hazard of mycotoxin to the animal and the detection methods in the feed and animal tissues to perfect the mycotoxin detection methods and reduce the hazard of mycotoxin to the animal.

mycotoxin; hazard; detection method

2014-09-10，

2014-10-08

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系家禽創(chuàng)新團隊項目 (SDAIT-13-011-09)

張志美(1979-)，女，山東煙臺人，助理研究員，博士研究生，主要從事新獸藥的研發(fā)與應用。 E-mail：sesame_1979@163.com

*[通訊作者] 沈志強(1963-)，男，山東威海人，研究員，主要從事預防獸醫(yī)學研究。E-mail：bzshenzq@163.com

S811.6

A

1005-5228(2015)01-0087-04