基因工程細(xì)胞移植治療坐骨神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展

·綜述·

基因工程細(xì)胞移植治療坐骨神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展

Research progress on transplantation of gene engineering cells for repairing the sciatic nerve injury

賀菊芳，余資江(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

[關(guān)鍵詞]基因轉(zhuǎn)染；坐骨神經(jīng)損傷；修復(fù)與再生

坐骨神經(jīng)是人體最粗大的神經(jīng)，主要支配股二頭肌長(zhǎng)頭、半腱肌、半膜肌和大收肌、小腿及足的全部肌肉以及除隱神經(jīng)支配區(qū)以外的小腿與足的皮膚感覺(jué)。在損傷嚴(yán)重的情況下，遠(yuǎn)段發(fā)生的軸突壞死、髓鞘分解消失和神經(jīng)鞘膜增生等，即“瓦勒變性”過(guò)程，引起股后部肌肉及小腿和足部所有肌肉全部癱瘓，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不能屈、踝關(guān)節(jié)與足趾運(yùn)動(dòng)功能完全喪失，呈足下垂，且小腿后外側(cè)和足部感覺(jué)喪失，足部出現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性改變，可嚴(yán)重影響傷者的日常生活。坐骨神經(jīng)損傷為臨床常見(jiàn)且術(shù)后修復(fù)效果不佳，如何修復(fù)其損傷、修復(fù)后的效果如何等難題已成為基礎(chǔ)與臨床研究的重要熱門課題。基因工程細(xì)胞[1-2]，即在體外對(duì)供體細(xì)胞用基因重組技術(shù)導(dǎo)入或刪除某一或某些基因以改變細(xì)胞的表型(包括生長(zhǎng)特性、對(duì)毒物的抵抗力以及生產(chǎn)分泌某些治療性蛋白)等，即進(jìn)行遺傳修飾過(guò)的細(xì)胞。因此基因工程細(xì)胞技術(shù)結(jié)合顯微手術(shù)的應(yīng)用，使得坐骨神經(jīng)損傷后康復(fù)的效果更加理想。本文結(jié)合近些年國(guó)內(nèi)外熱門研究的幾種基因工程細(xì)胞，用于移植治療動(dòng)物模型坐骨神經(jīng)損傷的研究現(xiàn)狀進(jìn)行闡述。

1神經(jīng)干細(xì)胞

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一種高度未分化具有自我更新和多向分化潛能的母干細(xì)胞。在損傷或者病理狀態(tài)下，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞受局部微環(huán)境的影響可以及時(shí)準(zhǔn)確地向損傷部位遷移，并向特定細(xì)胞類型分化，使神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或退行性疾病得以恢復(fù)相應(yīng)功能[3]，橋接功能賦予其在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中具有很大潛能。此外，神經(jīng)干細(xì)胞也可廣泛應(yīng)用于潛在的治療性轉(zhuǎn)基因載體，并且還能為在功能上高效穩(wěn)定表達(dá)有效因子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物提供平臺(tái)[2，4]。

多方面的生物優(yōu)勢(shì)使得神經(jīng)干細(xì)胞在基礎(chǔ)研究中占據(jù)重要地位。Fu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修飾的神經(jīng)干細(xì)胞(通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)在轉(zhuǎn)錄水平上持續(xù)6周表達(dá))，具有促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的應(yīng)用潛力。雷正旺等[6]研究還發(fā)現(xiàn)利用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)肌內(nèi)注射使局部釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3加快軸突再生速度以促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生，有效減緩了失神經(jīng)支配肌肉的萎縮。這些很好地證明了在坐骨神經(jīng)的修復(fù)與再生試驗(yàn)中，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的可以充分利用神經(jīng)干細(xì)胞的橋接作用、自我更新和多向分化潛能并在局部釋放有效因子，同時(shí)也驗(yàn)證了它在神經(jīng)損傷后的遷徙特性。

2施旺細(xì)胞

施旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，沿著神經(jīng)元的軸突分布，反復(fù)包裹著軸突形成髓鞘。髓鞘表面固有的一層基膜能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在周圍神經(jīng)再生中起到很重要的作用，主要是促進(jìn)受損的神經(jīng)元的存活和軸突的再生。當(dāng)神經(jīng)被切斷后，受到破壞的施旺細(xì)胞立即在軸突斷端發(fā)生封閉保護(hù)，以防止健康的軸突軸漿流失和彌散性潰變，進(jìn)而起到神經(jīng)的重要作用。

胡蓮美等[7-8]實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，成功地將外源性基因神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子導(dǎo)入施旺細(xì)胞中，使外源性基因成功表達(dá)，而且被轉(zhuǎn)染的施旺細(xì)胞仍保持較強(qiáng)的增殖能力，后將基因修飾的細(xì)胞與HHK(人發(fā)角蛋白)復(fù)合移植。實(shí)驗(yàn)3周后觀察到HHK絲間增生了大量排列整齊的施旺細(xì)胞和少量軸突；6周后HHK絲束中出現(xiàn)大量與正常神經(jīng)纖維基本一致的神經(jīng)纖維；9周后再生的神經(jīng)纖維明顯增多，有明顯的神經(jīng)外膜形成，增殖的組織中有新形成的微血管和排列規(guī)則的施旺細(xì)胞。Zong等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，NT-3基因修的飾施萬(wàn)細(xì)胞與PLGA管構(gòu)建的神經(jīng)移植復(fù)合體能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)的缺損再生，其再生的效果明顯優(yōu)于單NT-3基因組和施旺細(xì)胞組。施旺細(xì)胞是治療周圍神經(jīng)損傷的種子細(xì)胞，但分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有時(shí)效局限性[10-11],利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)彌補(bǔ)這一缺陷，為治療周圍神經(jīng)損傷提供另一條有效途徑。

3神經(jīng)元

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，由細(xì)胞體和長(zhǎng)的細(xì)胞軸突構(gòu)成。丁文彬[12]和高峰等[13]從家兔脊髓中提取骨髓源性神經(jīng)組織定向干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱為NTCSCs)作為母體細(xì)胞，使攜帶GFP病毒的NTCSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，培養(yǎng)出能夠進(jìn)行移植的干細(xì)胞源性神經(jīng)元細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5 cm的長(zhǎng)距離坐骨神經(jīng)缺損的家兔在8周后能正常行走，肌肉力量恢復(fù)良好，工程化神經(jīng)元組織能夠快速傳導(dǎo)生物電。12周時(shí)，檢測(cè)到腓腸肌蛋白含量趨向正常，經(jīng)過(guò)HKP示蹤法、透射電鏡、免疫組織化學(xué)檢測(cè)之后，發(fā)現(xiàn)受損坐骨神經(jīng)中植入的NTCSCs神經(jīng)元存活狀況良好。神經(jīng)元作為神經(jīng)組織的關(guān)鍵組成成分，用作于基因載體，對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)可起到重要作用。

4神經(jīng)前體細(xì)胞

神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)泛指處于發(fā)育更早期的細(xì)胞，是不甚嚴(yán)格的概念，屬于多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能、自我更新和增殖的能力，在特定的微環(huán)境變化中可分化為神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞[13]。人前腦啡肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的鎮(zhèn)痛介質(zhì),屬于一種內(nèi)源性的阿片肽，由前腦啡肽原經(jīng)酶切加工而來(lái)。有研究發(fā)現(xiàn),人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞后，可長(zhǎng)時(shí)間高水平地分泌高氨酸腦啡肽，在大鼠坐骨神經(jīng)鞘內(nèi)注射基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果[13]。

5骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類存在于骨髓中的原始細(xì)胞，在合適的條件下可分化為機(jī)體內(nèi)許多不同種類的細(xì)胞。其具有來(lái)源豐富、取材方便、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、免疫原性低和可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等優(yōu)點(diǎn)[14]，因此受到研究者們的青睞。Chen等[15]證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的的特點(diǎn)，使其向神經(jīng)樣細(xì)胞方向分化，為移植修復(fù)神經(jīng)損傷提供了證據(jù)。

近幾年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是國(guó)內(nèi)的熱門研究之一。張威等[16]用轉(zhuǎn)染NT-3的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合去細(xì)胞同種異體神經(jīng)作為坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的材料，有效提高了神經(jīng)傳導(dǎo)速度的恢復(fù)，對(duì)靶器官也具有明顯的促進(jìn)作用。陳解元等[17]使用大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型，鞘內(nèi)注射人前腦啡肽原基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人前腦啡肽原mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，減輕了神經(jīng)病理性疼痛。楊勁松等[18]使用基因工程的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯促進(jìn)了兔坐骨神經(jīng)的再生。鄭明輝等[19]的試驗(yàn)中，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療坐骨神經(jīng)損傷，對(duì)神經(jīng)纖維的再生和功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用,這與Ding等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

6肌源細(xì)胞

肌源細(xì)胞(myogentic cells)起源于胚胎血管祖細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)娜藶榄h(huán)境下也可分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同胚層的組織細(xì)胞。這種具有可塑性強(qiáng)、分布廣泛、來(lái)源豐富的肌源細(xì)胞，為自體干細(xì)胞治療退行性疾病或組織器官損傷的修復(fù)提供理想的種子細(xì)胞。Dadon-Nachum等[21]研究了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修飾肌源細(xì)胞在大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型的治療效果。在試驗(yàn)中，他們分別給肌源細(xì)胞單一轉(zhuǎn)染腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子后混合培養(yǎng)，從中獲取的培養(yǎng)基可以在低氧環(huán)境中減輕運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元系NSC34表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)。此外，被轉(zhuǎn)染的且存活下來(lái)的肌源細(xì)胞在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中表達(dá)和分泌上述神經(jīng)生長(zhǎng)因子，移植后4種神經(jīng)生長(zhǎng)因子在協(xié)同作用下可減輕坐骨神經(jīng)損傷。

7存在的問(wèn)題和展望

坐骨神經(jīng)損傷是常見(jiàn)的周圍神經(jīng)損傷，在當(dāng)前受到廣泛的關(guān)注和研究。目前基礎(chǔ)研究主要是通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使目的細(xì)胞大量表達(dá)特定蛋白來(lái)改善局部微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)與再生，其效果相對(duì)于神經(jīng)移植和單純性的細(xì)胞移植要明顯。然而基因工程細(xì)胞技術(shù)當(dāng)前還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，在臨床上應(yīng)用甚少，且基因工程細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷的機(jī)制、選何種目的細(xì)胞及表達(dá)的特定蛋白等問(wèn)題，都有待于進(jìn)一步的深入研究。基因工程細(xì)胞技術(shù)作為一種新的治療手段得到了重視，應(yīng)聯(lián)合外科顯微技術(shù)、藥物治療、針灸等多種治療方法聯(lián)合，通過(guò)綜合治療，相信將會(huì)在周圍神經(jīng)自體移植或神經(jīng)導(dǎo)管支架橋接手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用并起到更好的治療效果，從而減輕患者術(shù)后的活動(dòng)不便和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Maurer MH,Thomas C,Bürqers HF,et al.Transplantation of adult neural progenitor cells transfected with vascular endothelial growth factor rescues grafted cells in the rat brain[J].Int J Biol Sci,2008,4(1):1-7.

[2] Zheng XR,Zhang SS,Yin F,et al.Neuroprotection of VEGF-expression neural stem cells in neonatal cerebral palsy rats[J].Behav Brain Res,2012,230(1): 108-115.

[3] 康莊,胡志強(qiáng).神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及分化調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(23):3929-3932.

[4] Flax JD,Aurora S,Yang C,et al.Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues,replace neurons,and express foreign genes[J].Nat Biotechnol,1998,16(11):1033-1039.

[5] Fu KY,Dai LG,Chiu IM,et al.Sciatic nerve regeneration by microporous nerve conduits seeded with glial cell line-derived neurotrophic factor or brain-derived neurotrophic factor gene transfected neural stem cells[J].Artif Organs,2011,35(4):363-372.

[6] 雷正旺,薄占東,洪光祥,等.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)周圍神經(jīng)再生修復(fù)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2005,22(1):80-82.

[7] 胡蓮美,樸英杰,武雷,等.人發(fā)角蛋白絲束修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志,2005,23(2):172-176.

[8] 胡蓮美,樸仲賢,王啟偉,等.大鼠坐骨神經(jīng)切除后人發(fā)角蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)的再生機(jī)制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(7):1136-1140.

[9] Zong HB,Zhao HX,Zhao YL,et al.Nanoparticles carrying neurotrophin-3-modified Schwann cells promote repair of sciatic nerve defects[J].Neural Regeneration Research，2013,8(14):1262-1268.

[10] Liu G,Wang X,Shao G,et al.Genetically modified Schwann cells producing glial cell line-derived neurotrophic factor inhibit neuronal apoptosis in rat spinal cord injury[J].Mol Med Rep,2014,9(4):1305-1312.

[11] Svaren J,Meijer D.The molecular machinery of myelin gene transcription in Schwann cells[J].Glia,2008,56(14):1541-1551.

[12] 丁文彬.GFP轉(zhuǎn)染的骨髓來(lái)源神經(jīng)元樣細(xì)胞橋接修復(fù)坐骨神經(jīng)長(zhǎng)距離缺損的研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2013.

[13] 高峰,田玉科,楊輝,等.鞘內(nèi)移植hPPE修飾INPC對(duì)大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[J].中華麻醉學(xué)雜志,2007,27(3):264-267.

[14] Neuhuber B,Timothy HB,Shumsky JS,et al.Axon growth and recovery of function supported by human bone marrow stromal cells in the injured spinal cord exhibit donor variations[J].Brain Res,2005,1035(1):73-85.

[15] Chen SH,Wanq JJ,Chen CH,et al.Umbilical cord blood-derived CD34+cells improve outcomes of traumatic brain injury in rats by stimulating angiogenesis and neurogenesis[J].Cell Transplant,2014,23(8):959-979.

[16] 張威,周明武,幸超峰,等.NT-3轉(zhuǎn)染的BMSCs聯(lián)合異體去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2013,30(10):907-911.

[17] 陳解元,孫怡,趙國(guó)棟.神經(jīng)病理性痛大鼠鞘內(nèi)注射人前腦啡肽原基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鎮(zhèn)痛效果[J].中華麻醉學(xué)雜志,2010,30(12):1437-1439.

[18] 楊勁松,陳崢嶸.攜帶膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔坐骨神經(jīng)缺損的治療作用[J].中華創(chuàng)傷雜志,2010,26(11):1030-1034.

[19] 鄭明輝,張志堅(jiān),黃東煜,等.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療坐骨神經(jīng)損傷[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(1):120-124.

[20] Ding P,Yang Z,Wang W,et al.Transplantation of bone marrow stromal cells enhances infiltration and survival of CNP and Schwann cells to promote axonal sprouting following complete transection of spinal cord in adult rats[J].Am J Transl Res,2014,6(3):224-235.

[21] Dadon-Nachum M,Ben-Zur T,Srugo I,et al.herapeutic effect of myogenic cells modified to express neurotrophic factors in a rat model of sciatic nerve injury[J].J Stem Cells Regen Med,2012,8(1):21-27.

(編輯：周小林)

[中圖分類號(hào)]R322.85

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)06-0666-03

[收稿日期]2015-05-16[修回日期] 2015-06-10

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81060108)；貴州省科技廳2012年社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY字[2012]3153號(hào))

doi:10.11659/jjssx.01E015003