結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)結(jié)核性胸腔積液診斷價(jià)值的研究

許雪成，茅利明

(1.紹興縣柯橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，浙江紹興312030; 2.紹興縣中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江紹興312030)

結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)結(jié)核性胸腔積液診斷價(jià)值的研究

許雪成1，茅利明2

(1.紹興縣柯橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，浙江紹興312030; 2.紹興縣中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江紹興312030)

目的探討結(jié)核分枝桿菌(MTB)T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T－SPOT)在疑似MTB感染伴胸腔積液患者快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法疑似MTB感染伴胸腔積液患者124例，應(yīng)用T－SPOT檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞對(duì)MTB特異性分泌蛋白EAST－6和CFP－10的免疫反應(yīng)。利用MTB DNA法檢測(cè)胸腔積液中的MTB，同時(shí)用免疫金標(biāo)法檢測(cè)血清MTB抗體，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果124例疑似患者經(jīng)過痰和胸腹水抗酸染色鏡檢、痰液和胸腹水MTB培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、MTB DNA和MTB抗體等試驗(yàn)確診結(jié)核病患者44例，陽性檢出率為35.5%。T－SPOT的陽性檢出率為33.06%(41/124)，MTB DNA的陽性檢出率為14.52%(18/124)，血清MTB抗體的陽性檢出率為9.68%(12/124)。對(duì)已確診的44例結(jié)核病患者進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，T－SPOT、MTB DNA和血清MTB抗體的準(zhǔn)確率分別為86.36%(38/44)、27.27%(12/44)和18.18%(8/44)。T－SPOT的陽性檢出率和結(jié)核診斷的準(zhǔn)確率均顯著高于其它2種方法(P＜0.05)。T－SPOT對(duì)疑似MTB感染的胸腔積液患者診斷的陽性預(yù)測(cè)值為92.68%，陰性預(yù)測(cè)值為92.77%。結(jié)論T－SPOT對(duì)疑似MTB感染伴胸腔積液患者的診斷具有快速、高敏感性和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于MTB DNA和血清MTB抗體試驗(yàn)，可以作為一種新的技術(shù)應(yīng)用于人體MTB感染的診斷。

T細(xì)胞試驗(yàn);DNA;抗體;結(jié)核分枝桿菌;胸腔積液

胸腔積液是臨床最常見的癥候群，可由惡性腫瘤、肺結(jié)核和胸膜結(jié)核等疾病引起?；颊叱蔬M(jìn)行性加重的胸痛和呼吸困難，伴胸水(可為血性)，增長(zhǎng)速度快，患者的生命受到嚴(yán)重影響。惡性腫瘤引起的胸腔積液可以由腫瘤標(biāo)志物的血清學(xué)檢查和胸水查找癌細(xì)胞的病理學(xué)檢查等一系列檢查快速確診。而肺結(jié)核或胸膜結(jié)核引起的胸腔積液，因?yàn)榭顾崛旧R檢、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)培養(yǎng)和血清MTB抗體的陽性檢出率低，MTB培養(yǎng)方法存在敏感性低，檢測(cè)周期長(zhǎng)等問題，導(dǎo)致臨床診斷困難。MTB T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T cells spot test，T－SPOT)是檢測(cè)外周血分泌γ干擾素(interferon gamma，IFN－γ)的T淋巴細(xì)胞數(shù)量的試驗(yàn)，近幾年在歐美國家已被證實(shí)為在MTB感染檢測(cè)中具有較好的特異性和敏感性，被廣泛用于臨床常規(guī)檢測(cè)[1]。本研究擬探討外周血T－SPOT在明確胸腔積液性質(zhì)(結(jié)核性)的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2012年2月至2013年6月因患有胸腔積液而在紹興縣中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科等相關(guān)科室住院的患者。入選標(biāo)準(zhǔn):咳嗽，呼吸急促、困難，胸部X片和計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查提示伴有中等量胸腔積液的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院前，已經(jīng)實(shí)施抗結(jié)核治療＞1個(gè)月者;(2)合并糖尿病以及嚴(yán)重的肝功能、腎功能異?；蛐墓δ懿蝗颊?(3)人類免疫缺陷病毒陽性患者。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)共入選患者124例，其中男80例，女44例，中位年齡59.4 (36～75)歲。均符合2008年8月1日實(shí)施的中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

二、方法

1.標(biāo)本收集住院患者均在清晨安靜狀態(tài)下采集血液標(biāo)本。檢測(cè)T－SPOT所需要的標(biāo)本為:成人抽全血量為4～5 mL，免疫力低或白細(xì)胞少的患者抽取8～10 mL，置于肝素抗凝管，充分混勻。檢測(cè)MTB抗體的血清標(biāo)本為2 mL全血并置于生化管，靜置后在1 500×g離心力下離心5 min分離血清標(biāo)本備用。MTB DNA法需采集胸腔積液，1 500×g離心取沉渣備用。

2.T－SPOT使用英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的試劑盒。采集患者外周血并分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PMBC)，用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到2.5×106/mL。在陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、A和B孔中分別加入50 μL的無血清培養(yǎng)液、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)對(duì)照、EAST－6和CFP－10。然后每孔加入100 μL的2.5×106/mL的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞溶液，37℃5%CO2環(huán)境下孵育16～20 h。磷酸鹽緩沖液洗板4次后加入酶結(jié)合物溶液于每孔，2～8℃孵育1 h。洗板4次后拍干，加入顯色劑，室溫孵育10 min。用蒸餾水洗滌4次后充分拍干。用計(jì)算機(jī)輔助成像技術(shù)分析系統(tǒng)進(jìn)行斑點(diǎn)的閱讀與統(tǒng)計(jì)。結(jié)果判斷按照試劑盒說明書進(jìn)行，即當(dāng)EAST－6或CFP－10測(cè)試孔中的任一個(gè)達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)就判斷為陽性:(1)陰性對(duì)照孔點(diǎn)數(shù)0～5，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)－陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6;(2)若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)應(yīng)≥2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。

3.MTB DNA檢測(cè)胸腔積液沉渣抽提MTB DNA，檢測(cè)試劑盒由廣東達(dá)安基因有限公司提供，試劑盒在有效期內(nèi)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀為美國ABI公司的7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

4.血清MTB抗體檢測(cè)檢測(cè)所用試劑為上海奧普生物醫(yī)藥公司提供的MTB抗體膠體金法診斷試劑盒，實(shí)驗(yàn)原理為斑點(diǎn)免疫金滲濾法。

5.其它確診試驗(yàn)用于確診MTB感染的其它試驗(yàn)包括胸水抗酸染色鏡檢、胸水MTB培養(yǎng)和結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)等，均按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2種方法的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、124例疑似MTB 感染的胸腔積液患者T－SPOT、MTB DNA的陽性率及準(zhǔn)確率比較

124例疑似MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB DNA檢測(cè)，兩者同時(shí)陽性16例，T－SPOT陽性而MTB DNA陰性25例，MTB DNA陽性而T－SPOT陰性2例，T－SPOT的陽性檢出率為33.06%，MTB DNA的陽性檢出率為14.52%，2種方法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.7，P＜0.05)。見表1。

44例確診MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB DNA檢測(cè)，兩者同時(shí)陽性8例，T－SPOT陽性而MTB DNA陰性30例，MTB DNA陽性而T－SPOT陰性4例，T－SPOT的準(zhǔn)確率為86.36%，MTB DNA的準(zhǔn)確率為27.27%，2種方法的準(zhǔn)確率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.436，P＜0.05)。見表2。

二、124例疑似MTB感染的胸腔積液患者T－SPOT、血清MTB抗體的陽性率及準(zhǔn)確率比較

124例疑似MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB抗體檢測(cè)，兩者同時(shí)陽性8例，TSPOT陽性而MTB抗體陰性33例，MTB抗體陽性而T－SPOT陰性4例，T－SPOT的陽性檢出率為33.06%，MTB抗體的陽性檢出率為9.68%，2種方法的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 20.1，P＜0.05)。見表3。

44例確診MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB抗體檢測(cè)，兩者同時(shí)陽性5例，T－SPOT陽性而MTB抗體陰性33例，MTB抗體陽性而T－SPOT陰性3例，T－SPOT的準(zhǔn)確率為86.36%，MTB抗體的準(zhǔn)確率為18.18%，2種方法的準(zhǔn)確率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 4.728，P＜0.05)。見表4。

三、124例疑似MTB感染的胸腔積液患者TSPOT、MTB DNA及MTB抗體檢測(cè)

結(jié)果見表5。

討論

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如痰涂片抗酸染色鏡檢、痰液MTB培養(yǎng)、結(jié)合菌素皮膚試驗(yàn)等都存在著敏感性低、檢測(cè)周期長(zhǎng)等問題。因此結(jié)核病的早期快速診斷與治療已成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵因素。隨著科技發(fā)展，近年來發(fā)展起來的以T細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的IFN－γ釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assays，IGRAs)被廣泛應(yīng)用于歐美國家的各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)，列入結(jié)核病診療指南[2]。IGRAs的原理為:機(jī)體首次感染MTB后，體內(nèi)產(chǎn)生的記憶T淋巴細(xì)胞將長(zhǎng)期存活于人體內(nèi)。當(dāng)機(jī)體再次受到MTB感染時(shí)，記憶T細(xì)胞迅速增殖為效應(yīng)T細(xì)胞，分泌IFN－γ以及其它一些細(xì)胞因子刺激T淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)激活巨噬細(xì)胞。T－SPOT利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)MTB特異性的抗原EAST－6和CFP－10[3]。由于IGRAs技術(shù)使用的抗原來自于MTB基因組具有而卡介苗缺失的RD區(qū)域(region of difference)，所以能夠較好地區(qū)別卡介苗接種和MTB感染，具有較低的假陽性率，特異性較結(jié)核菌素試驗(yàn)有較大提高。從表5中的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)我們可以知道，T－SPOT在結(jié)核病的診斷中敏感性為86.36%，特異性為96.25%。而據(jù)DIEL等[4]的Meta數(shù)據(jù)分析報(bào)道，T－SPOT診斷肺結(jié)核的敏感性為85%～90%。本研究數(shù)據(jù)與國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道近似。

由表1可知，124例疑似MTB感染的胸腔積液患者用T－SPOT和MTB DNA檢測(cè)，兩者同時(shí)陽性者16例，T－SPOT單獨(dú)檢測(cè)陽性者33例，MTB DNA單獨(dú)檢測(cè)陽性者2例，2種方法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.7，P＜0.05)。而同樣根據(jù)表3可知，對(duì)于T－SPOT和MTB抗體的陽性率比較，兩者同時(shí)陽性8例，MTB抗體單獨(dú)檢測(cè)陽性4例，2種方法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.1，P＜0.05)。同時(shí)，124例疑似MTB感染的胸腔積液患者經(jīng)過系統(tǒng)痰涂片抗酸染色鏡檢、胸水涂片抗酸染色鏡檢和胸水MTB培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、MTB DNA和MTB抗體等試驗(yàn)確診患結(jié)核感染44例，陽性率為35.5%。T－SPOT對(duì)結(jié)核病的診斷準(zhǔn)確率為86.36%，且具有較好的特異性，與參考文獻(xiàn)[5]一致。本研究中44例確診的結(jié)核病患者中，按照T－SPOT檢測(cè)出41例，剩余3例陰性患者，除了試劑本身敏感性所限外，也有可能是實(shí)驗(yàn)操作過程中PMBC提取丟失造成的假陰性。此外，T－SPOT還受諸多因素的影響，如年齡、營養(yǎng)不良、化療和其它傳染性疾病等[6]。

綜上所述，T－SPOT在診斷MTB感染的胸腔積液患者中具有快速、敏感性較高的優(yōu)點(diǎn)，可以與其它診斷方法聯(lián)合應(yīng)用提高結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確性，對(duì)于臨床上快速鑒別診斷胸腔積液患者是否為MTB感染具有重要的價(jià)值，而且其不受卡介菌和其它分枝桿菌的影響。因此，T－SPOT作為一種新的診斷技術(shù)，在結(jié)核病的快速臨床診斷中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。但由于目前該試驗(yàn)的費(fèi)用比較高，在一定程度上限制了該技術(shù)的推廣。相信隨著國產(chǎn)替代試劑的開發(fā)，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷會(huì)達(dá)到一個(gè)新的層面。

[1]LAVLANI A.Diagnosing tuberculosis infection in 21st century:new tools to tackle an old enemy[J].Chest，2007，131(6):1898－1906.

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[5]王森，陳嘉臻，張舒，等.血清學(xué)診斷方法及T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J].中華臨床感染病雜志，2013，6(1):13－17.

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Study on the diagnostic significance of T cells spot test in Mycobacterium tuberculosis infected patients with pleural effusion

XU Xuecheng1，MAO Liming2.(1.Department of Clinical Laboratory，Keqiao Community Health Center，Zhejiang Shaoxing 312030，China;2.Department of Clinical Laboratory，Shaoxing County Central Hospital，Zhejiang Shaoxing 312030，China)

ObjectiveTo investigate the application significance of Mycobacterium tuberculosis(MTB)T cells spot test(T－SPOT)in the rapid diagnosis for suspected MTB infected patients with pleural effusion.MethodsThe 124 patients with pleural effusion which were suspected as having suspected MTB infection were enrolled.T－SPOT was used to detect the immune response of peripheral blood lymphocyte against MTB special secreted protein EAST－6 and CFP－10.The MTB DNA method was used to detect MTB in pleural effusion，meanwhile serum anti－MTB antibody was detected by immuno－gold filtration assay，and the results were analyzed statistically.ResultsThe 44 of 124 cases were diagnosed as tuberculosis by sputum，pleural effusion and ascites smear test，sputum，pleural effusion and ascites MTB culture，tuberculin test，MTB DNA method and anti－MTB antibody test，and the positive rate was 35.5%.The positive rate of T－SPOT in the 124 patients with pleural effusion was 33.06%(41/124).The positive rate of MTB DNA method was 14.52%(18/124)，and that of anti－MTB antibody test was 9.68%(12/124).Among the 44 confirmed tuberculosis patients，T－SPOT had the consistency rate of 86.36%(38/44)，while the consistency rates of MTB DNA method and anti－MTB antibody test were 27.27%(12/44)and 18.18%(8/44)，respectively.The positive rate and consistency rate of T－SPOT were significantly higher than those of the others(P＜0.05).The positive and negative predictive values of T－SPOT in suspected MTB infected patients with pleural effusion were 92.68%and 92.77%，respectively.ConclusionsT－SPOT is fast，sensitive and specific to diagnose the suspected MTB infected patients with pleural effusion.T－SPOT is better than MTB DNA method and anti－MTB antibody test.T－SPOT can become a new diagnostic method to be applied in the diagnosis of MTB infection.

T cells spot test;DNA;Antibody;Mycobacterium tuberculosis;Pleural effusion

1673－8640(2015)03－0254－04

R446.5

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.013

2014－02－10)

(本文編輯:姜敏)

許雪成，男，1977年生，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。