蛋白質(zhì)組學在結(jié)直腸癌生物學特性研究中的意義

柴曉玲，陸建波

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，云南昆明 650032）

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤。近年來結(jié)直腸癌患者的發(fā)病率、病死率有了明顯降低，生存率和生活質(zhì)量有了極大提高。這無不與近年來在腫瘤臨床研究中廣泛采用分子生物學技術(shù)密切有關，特別是對結(jié)直腸癌生物學特性的探討，揭示了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的腫瘤細胞生長特點、增殖與凋亡能力、侵襲與轉(zhuǎn)移機制及腫瘤細胞抗藥性機制。腫瘤病理學的研究，已不單純從病理組織形態(tài)學、免疫組織化學上去分析，而結(jié)合多種新技術(shù)如原位雜交、基因擴增、基因測序等分子病理檢測技術(shù)，尤其是近年來快速發(fā)展的組學技術(shù)，包括基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的復雜過程，而基因功能的發(fā)揮是通過蛋白質(zhì)實現(xiàn)的。腫瘤細胞的增殖與凋亡，不僅決定了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且一定程度上影響了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。某些蛋白質(zhì)的改變打破了細胞正常的凋亡與增殖之間的平衡，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移［1］。而且發(fā)現(xiàn)腫瘤對眾多化療藥物產(chǎn)生耐藥性，大部分與某些結(jié)構(gòu)蛋白的改變相關［2］。因此，基因組學和蛋白質(zhì)組學的研究將會有助于從源頭上揭示腫瘤的生物學特性變化規(guī)律及原因。

1 結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)組學研究

結(jié)直腸組織從正常到癌變，可出現(xiàn)一系列蛋白質(zhì)異常表達。如與能量代謝有關的蛋白質(zhì)?；o酶A脫氫酶和琥珀酸脫氫酶過氧化物還原酶6表達明顯下調(diào)，糖酵解相關蛋白二磷酸果糖酶表達明顯上調(diào)［3］。染色體重構(gòu)蛋白的異常表達在結(jié)腸腫瘤的形成中也有不容忽視的作用，作為染色體重構(gòu)蛋白的一員，Rsf-1的擴增產(chǎn)物可以誘導染色體不穩(wěn)定，進而引發(fā)腫瘤形成［4］。在結(jié)腸癌發(fā)展過程中，可出現(xiàn)微管蛋白（end-binding protein）EB1表達上調(diào)，同時伴隨Adenomatous polyposis coli（APC）蛋白表達下調(diào)，通過siRNA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EB1和APC共同調(diào)節(jié)紡錘體有絲分裂、染色體校準和微管穩(wěn)定性。當APC與EB1相互作用發(fā)生異常時，包括APC突變或EB1過度表達，會出現(xiàn)染色體異常分離，腫瘤細胞增多［5］，加速結(jié)腸癌的發(fā)展。

Caveolin-1（CAV-1）是caveolae的主要成分，是相對分子質(zhì)量21～24 ku的蛋白質(zhì)。大部分結(jié)腸癌細胞中CAV-1蛋白質(zhì)水平明顯降低，裸鼠成瘤實驗中發(fā)現(xiàn)，CAV-1的過度表達可以減緩腫瘤的形成，說明它的表達可以負性調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。

結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，有多種蛋白質(zhì)發(fā)生改變，這些改變的蛋白質(zhì)可以相互作用、相互影響和不斷發(fā)生變化。蛋白質(zhì)組學就是要研究各種蛋白質(zhì)變化的時序和在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程起主導作用的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，從而尋求能夠抑制或拮抗腫瘤細胞蛋白質(zhì)的方法，達到治療腫瘤的目的。

2 結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)組學研究

結(jié)直腸腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因，蛋白質(zhì)組學技術(shù)是探討腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白質(zhì)的有效手段。通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)38種蛋白質(zhì)在原發(fā)性結(jié)腸癌和結(jié)腸癌淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移的組織中差異表達。其中FXYD3和S100A11表達明顯下調(diào)，GSTM3表達明顯上調(diào)，與淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移密切相關［7］。

曾有學者用血小板懸浮液培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞，通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)血小板可以刺激P38 MAPK磷酸化，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9蛋白水平。當沉默含血小板培養(yǎng)的腫瘤細胞中的P38，發(fā)現(xiàn)MMP-9水平下調(diào)，認為P38 MAPK調(diào)控MMP-9的表達。所以，在含有血小板的培養(yǎng)基中進行結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)，血小板產(chǎn)生的血小板反應蛋白和叢生蛋白通過激活P38/MAPK信號通路，可以增強MMP-9的活性，進一步促進結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。

3 結(jié)直腸癌細胞增殖與凋亡的蛋白質(zhì)組學研究

腫瘤細胞的增殖與凋亡貫穿腫瘤發(fā)生發(fā)展的始終，這是研究腫瘤的發(fā)病機理及浸潤轉(zhuǎn)移的最重要線索，其相關蛋白也是治療腫瘤的靶點。當調(diào)控細胞增殖與凋亡的相關蛋白質(zhì)發(fā)生改變，會促進或抑制腫瘤的形成。異源三聚體G蛋白是水解酶家族的一員，它包括Gα和Gβγ亞單位，其中Gβ5可以作為NF-κB轉(zhuǎn)錄的輔助因子，而NF-κB信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖方面有重要意義。另外，Gβ5可以誘導抗凋亡蛋白XIAP產(chǎn)生，而XIAP可以激活NF-κB信號通路。由此推測，Gβ5是通過誘導抗凋亡蛋白XIAP產(chǎn)生和激活NF-κB信號通路來調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖［9］。JMJD6，一種 Jumonji C domain-containing蛋白，可以作為酮戊二酸賴氨?；u化酶，催化P53的賴氨酸382發(fā)生羥基化，對抗P53乙?；龠MP53與它的負性調(diào)控者MDMX結(jié)合，抑制P53的轉(zhuǎn)錄活性。進一步通過siRNA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)JMJD6的沉默可以增加P53的轉(zhuǎn)錄活性，細胞阻滯在G1期，細胞凋亡數(shù)增加［10］。所以，JMJD6具有促進細胞增殖的功能。

通過2D雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)直腸癌組織和正常組織的蛋白質(zhì)表達譜，發(fā)現(xiàn)36種蛋白質(zhì)差異表達，其中碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）改變最明顯，它在結(jié)直腸癌組織中表達明顯下調(diào)。建立碳酸酐酶Ⅱ過度表達的結(jié)直腸癌細胞SW480，發(fā)現(xiàn)細胞周期停滯在G0/G1和G2期［11］，進而抑制細胞增殖。SERPINA3K，又稱激肽釋放酶相關蛋白（KBP），是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。它可以激活外源性死亡路徑，在含SERPINA3K的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)Fas配體蛋白水平上調(diào)。當Fas配體蛋白下調(diào)時，發(fā)現(xiàn)SERPINA3K誘導的細胞凋亡受到阻礙，可見SERPINA3K誘導腫瘤細胞凋亡依賴于Fas配體蛋白的表達。進一步通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，SERPINA3K是通過上調(diào)PPARγ蛋白水平激活Fas/FasL路徑，誘導細胞凋亡［12］。

4 結(jié)直腸癌對藥物產(chǎn)生耐藥性的蛋白質(zhì)組學研究

腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響了治療效果。以往對耐藥機制的研究多在基因水平，而蛋白質(zhì)組學技術(shù)從另一角度揭示了耐藥機制。研究發(fā)現(xiàn)?；撬徂D(zhuǎn)運子SLC6A6，這是一種多通道膜蛋白，它與腫瘤細胞對5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、阿霉素（doxorubicin，DOX）和喜樹堿類（SN-38）多種化療藥物耐藥密切相關。多藥耐藥的主要原因是 ATP綁定盒（ABC）轉(zhuǎn)運子如 MDR1或ABCG2的過度表達。在SLC6A6沉默的細胞中，發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運子的活性處于激活狀態(tài)，但ABC轉(zhuǎn)運蛋白MDR1和ABCG2的表達和功能均無變化，而且藥物的活性也未減弱，說明這種細胞對由化療藥物介導的凋亡是敏感的。但在SLC6A6高表達的細胞中，它不但能夠?qū)褂苫熕幬镆鸬牡蛲?，還能直接抵抗細胞凋亡。所以，SLC6A6的過度表達導致結(jié)腸癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性［13］。PEA-15蛋白是一種多功能的小磷蛋白，它的高表達可以對抗死亡配體TRAIL的表達和由化療藥物引起的細胞毒性，增加腫瘤細胞的耐藥性［14］。

腫瘤抑制蛋白FOXO3A，通過上調(diào)促凋亡基因P21、PTEN、Bim和 GADD45的轉(zhuǎn)錄活性，增加 Bax依賴的細胞凋亡能力，降低腫瘤細胞的生存能力，進而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［15］。HIV-1病毒蛋白R（VPR）是含96種氨基酸的14 ku的蛋白質(zhì)，它通過調(diào)控細胞周期停滯在G2期，促進Bax蛋白的表達，加強線粒體細胞色素C的釋放，降低Bcl-xl蛋白的表達，抑制NF-κB的激活，加速細胞凋亡，導致腫瘤細胞耐藥性降低［16］。質(zhì)譜分析經(jīng)姜黃素和伊立替康處理的結(jié)直腸癌細胞LOVO，出現(xiàn)54種差異蛋白質(zhì)的表達。通過研究發(fā)現(xiàn)過氧化物還原酶4和蛋白二硫化物異構(gòu)酶的差異表達意義重大。由于二硫化物對于維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用，而姜黃素和伊立替康可以通過影響過氧化物還原酶4和蛋白二硫化物異構(gòu)酶協(xié)同作用的發(fā)揮，破壞二硫化物形成，導致細胞LOVO凋亡，減少耐藥性的產(chǎn)生，加強治療效果［17］。

目前利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)的研究，主要是比較正常細胞與腫瘤細胞之間的差異蛋白質(zhì)，并對不同時期的腫瘤細胞中表達蛋白質(zhì)的種類進行定性和定量分析。所采用的技術(shù)有2D雙向凝膠電泳技術(shù)（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE）、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（electrospray tandem mass spectrometry，ESI MS/MS）等，尤其后者在不破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的情況下對樣品進行大量精確的測定。然而蛋白質(zhì)組學是一門新學科，技術(shù)還不成熟，在分離和鑒定腫瘤標志物方面還處于初級階段，對低豐度蛋白質(zhì)的檢測能力還不足，但結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中低豐度蛋白質(zhì)的表達具有重要意義。另外，測定差異蛋白質(zhì)的靈敏度和特異性及所測定的蛋白質(zhì)種類的信息量還有待進一步提高。

隨著科技的發(fā)展，基因組學與蛋白組學技術(shù)的成功聯(lián)合運用，特別是在結(jié)直腸腫瘤病因?qū)W與早期階段腫瘤細胞蛋白質(zhì)變化規(guī)律的研究，尋找到一組能夠阻斷腫瘤細胞異常增殖與凋亡的關鍵蛋白質(zhì)，為臨床腫瘤治療帶來新的曙光。

［1］Reimers MS，Zeestraten EC，van Alphen TC，et al.Combined analysis of biomarkers of proliferation and apoptosis in colon cancer:an immunohistochemistry-based study using tissue microarray［J］.Int J Colorectal Dis，2014，29:1043-1052.

［2］Yoshikawa S，Kukimoto-Niino M，Parker L，et al.Structural basis for the altered drug sensitivities of non-small cell lung cancer-associated mutants of human epidermal growth factor receptor［J］.Oncogene，2013，32:27-38.

［3］Peng Y，Li X，Wu M，et al.New prognosis biomarkers identi-fied by dynamic proteomic analysis of colorectal cancer［J］.Mol Biosyst，2012，8:3077-3088.

［4］Liu S，Dong Q，Wang E.Rsf-1 overexpression correlates with poor prognosis and cell proliferation in colon cancer［J］.Tumor Biol，2012，33:1485-1491.

［5］Stypula-Cyrus Y，Mutyal NN，Dela Cruz M，et al.End-binding protein 1（EB1）up-regulation is an early event in colorectal carcinogenesis［J］.FEBS Lett，2014，588:829-835.

［6］Nimri L，Barak H，Graeve L，et al.Restoration of caveolin-1 expression suppresses growth，membrane-type-4 metalloproteinase expression and metastasis-associated activities in colon cancer cells［J］.Mol Carcinog，2013，52:859-870.

［7］ Meding S，Balluff B，Elsner M，et al.Tissue Based Proteomics Reveals FXYD3，S100A11 and GSTM3 as Novel Markers for Regional Lymph Node Metastasis in Colon Cancer［J］.J Pathol，2012，doi:10.1002/path.4021.

［8］ Radziwon-Balicka A，Santos-Martinez MJ，Corbalan JJ，et al.Mechanisms of platelet-stimulated colon cancer invasion:role of clusterin and thrombospondin 1 in regulation of the P38MAPK-MMP-9 pathway［J］.Carcinogenesis，2014，35:324-332.

［9］Fuchs D，Metzig M，Bickeboller M，et al.The Gbeta5 protein regulates sensitivity to TRAIL-induced cell death in colon carcinoma［J］.Oncogene，2014，1-11.

［10］Wang F，He L，Huangyang P，et al.JMJD6 promotes colon carcinogenesis through negative regulation of p53 by hydroxylation［J］.PLoS Biol，2014，doi:10.1371/journal.pbio.1001819.

［11］Zhou R，Huang W，Yao Y，et al.CAⅡ，a potential biomarker by proteomic analysis，exerts significant inhibitory effect on the growth of colorectal cancer cells［J］.Int J Oncol，2013，43:611-621.

［12］Yao Y，Li L，Huang X，et al.SERPINA3K induces apoptosis in human colorectal cancer cells via activating the Fas/FasL/caspase-8 signaling pathway［J］.FEBS J，2013，280:3244-3255.

［13］Yasunaga M，Matsumura Y.Role of SLC6A6 in promoting the survival and multidrug resistance of colorectal cancer［J］.Sci Rep，2014，4:4852-4860.

［14］ Funke V，Lehmann-Koch J，Bickeboller M，et al.The PEA-15/PED protein regulates cellular survival and invasiveness in colorectal carcinomas［J］.Cancer Lett，2013，335:431-440.

［15］Germani A，Matrone A，Grossi V，et al.Targeted therapy against chemoresistant colorectal cancers:Inhibition of p38alpha modulates the effect of cisplatin in vitro and in vivo through the tumor suppressor FoxO3A［J］.Cancer Lett，2014，344:110-118.

［16］ Ma B，Zhang H，Wang J，et al.HIV-1 viral protein R（Vpr）induction of apoptosis and cell cycle arrest in multidrug-resistant colorectal cancer cells［J］.Oncol Rep，2012，28:358-364.

［17］Zhu DJ，Chen XW，Wang JZ，et al.Proteomic analysis identifies proteins associated with curcumin-enhancing efficacy of irinotecan-induced apoptosis of colorectal cancer LOVO cell［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7:1-15.