長(zhǎng)鏈非編碼RNA ANRIL的研究進(jìn)展

江 澈，王偉民

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 腦病中心，廣東 廣州510000)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是多細(xì)胞動(dòng)物基因組的一個(gè)重要特征，包括長(zhǎng)200～1 000 000bp 由DNA 轉(zhuǎn)錄而來但不編碼蛋白的RNA。高通量轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在大量lncRNA，廣泛參與機(jī)體的發(fā)育、分化、代謝等生理病理過程。ANRIL(antisense non coding RNA in the INK4 locus)是人Chr9p21 上CDKN2A/B 基因叢轉(zhuǎn)錄的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，主要定位于細(xì)胞核。該基因區(qū)域與人類的一些疾病相關(guān)，既往的研究提示ANRIL 在介導(dǎo)Chr9p21位點(diǎn)的功能中發(fā)揮重要作用。

1 人類ANRIL的序列和進(jìn)化特征

在對(duì)黑色素細(xì)胞瘤-神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤家族的遺傳研究中，人們首次發(fā)現(xiàn)在人類全血白細(xì)胞和類淋巴母細(xì)胞系內(nèi)存在一段位于INK4位點(diǎn)的反義非編碼RNA，并將其命名為ANRIL(GenBank accession No.DQ485453)[1]。ANRIL 也 被 稱 為CDKN2BAS 等。ANRIL 起源于胎盤哺乳動(dòng)物，在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中獲得了額外的外顯子，隨后在嚙齒類動(dòng)物的進(jìn)化中丟失了一部分，最終在猿類中完全形成，并變得高度保守[2]。編碼ANRIL 基因的序列位于Chr9p21.3位點(diǎn)，其長(zhǎng)度為126.3 kb。該基因可在與CDKN2A/B 基因叢相反的方向上選擇性轉(zhuǎn)錄20個(gè)外顯子，mRNA 全長(zhǎng)3 834 bp[3]。很多外顯子僅包含LINE、SINE 和Alu 重復(fù)元件。ANRIL的內(nèi)含子1 包含p15/CDKN2B的外顯子1 和2，其5'末端的外顯子1位于p14/ARF 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游～300 bp 處。ANRIL 由RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄，可被剪接形成至少20種線性轉(zhuǎn)錄子或環(huán)形轉(zhuǎn)錄子，這些剪接變異子具有組織特異性[3-4]。在小鼠體內(nèi)存在一段70 kb的基因序列，與人Chr9p21 上58 kb的冠心病危險(xiǎn)區(qū)域同源[5]，其缺失導(dǎo)致CDKN2A/B表達(dá)的嚴(yán)重下調(diào)。這段70 kb的序列包含一段反義非編碼RNA，但與人ANRIL 無同源性。

2 ANRIL的表達(dá)和調(diào)控

2.1 調(diào)控ANRIL表達(dá)的上游通路

一些9p21 上的SNPs 破壞了STAT1 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[6-7]，提示該位點(diǎn)的表達(dá)受到多種信號(hào)通路調(diào)控。該位點(diǎn)的SNPs 同時(shí)也能改變ANRIL的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)[4，8-12]，并影響ANRIL 對(duì)多種疾病的易感性。ANRIL的調(diào)控具有細(xì)胞型特異性。促炎因子INF-γ 激活轉(zhuǎn)錄因子STAT1，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ANRIL的表達(dá)，但抑制類淋巴母細(xì)胞ANRIL的表達(dá)[7]。在ANRIL 和ARF的基因間區(qū)域的CpG 島存在CCCTC 結(jié)合因子(CTCF)結(jié)合位點(diǎn)，CTCF 結(jié)合后保護(hù)DNA 不被甲基化，維持CDKN2A/B位點(diǎn)的穩(wěn)定[13]。DNA 損傷刺激中，轉(zhuǎn)錄因子E2F1 能以ATM依賴的方式上調(diào)ANRIL的表達(dá)，參與細(xì)胞DNA 修復(fù)[14]。此外，ANRIL 也受到microRNA的調(diào)控[15]。

2.2 ANIRL的下游通路

ANRIL的外顯子與其他功能性非編碼RNAs 一樣表達(dá)水平較低。較早發(fā)現(xiàn)的線性轉(zhuǎn)錄子有長(zhǎng)鏈的NR_003529 以及短鏈的DQ485454 和EU741058。二代測(cè)序的研究結(jié)果表明ANRIL 不同外顯子的含量存在差異[4]。ANRIL的功能不依賴于完整的轉(zhuǎn)錄子，存在的“莖環(huán)”等特殊結(jié)構(gòu)能被多梳(Polycomb)蛋白識(shí)別并結(jié)合，包含這些結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄子即能成為獨(dú)立的調(diào)控分子[16]。ANRIL的中央外顯子(4至12號(hào)外顯子)[4]形成環(huán)形同工型，其表達(dá)與心血管疾病危險(xiǎn)等位基因相關(guān)。

多梳蛋白是一組參與轉(zhuǎn)錄基因抑制的蛋白，具有多梳抑制性復(fù)合物1 和2(PRC1 和PRC2)兩種多蛋白復(fù)合物形式。PRC2 通過催化K27H3的甲基化參與基因沉默的啟動(dòng)，PRC1 通過單泛素化組蛋白H2A 參與靶基因沉默的維持。這些機(jī)制在細(xì)胞分化、細(xì)胞身份維持和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。ANRIL 能特異結(jié)合CBX7(PRC1 亞基)和SUZ12(PRC2 亞基)并調(diào)控CDKN2A/B位點(diǎn)的組蛋白修飾，啟動(dòng)并維持CDKN2A/B位點(diǎn)的沉默[17]。Dicer是RNA干擾機(jī)制的關(guān)鍵組分，負(fù)責(zé)siRNA 和miRNA的產(chǎn)生。ANRIL 也能以Dicer 蛋白依賴途徑[18]沉默CDKN2B。ANRIL 也有除CDKN2A/B 外的其他作用靶點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、細(xì)胞外基質(zhì)和炎性應(yīng)答等[6]。

3 ANRIL的功能以及在疾病中的表達(dá)

3.1 ANRIL 在腫瘤中的作用

ANRIL 與CDKN2A/B 基因座抑制相關(guān)。CDKN2A/B 基因座位于人類9號(hào)染色體p21 上，這段區(qū)域包括3個(gè)重要的腫瘤抑制基因:CDKN2A、CDKN2B和MTAP。其中CDKN2A 通過選擇性閱讀框編碼2個(gè)不同的蛋白，P16和ARF。該區(qū)域在30%～40%的人類腫瘤中發(fā)生改變。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)表明ANRIL是神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、黑色素細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、鼻咽癌和乳腺癌等腫瘤的危險(xiǎn)位點(diǎn)[17]。此外，ANRIL 還與前列腺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等腫瘤相關(guān)[15]。CDKN2A/B位點(diǎn)在年輕的健康細(xì)胞中被沉默，衰老和致癌因素能刺激其表達(dá)。該位點(diǎn)升高的表達(dá)與一些老化組織的再生潛能損害有關(guān)。CDKN2A/B 在人類腫瘤中被廣泛沉默，提示其在抑制腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。ANRIL 通過直接結(jié)合CDKN2B 轉(zhuǎn)錄子并募集PRC來抑制CDKN2A/B 基因座上的基因。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)條件，ANRIL的缺失或沉默與增殖降低相關(guān)[11]。降低的增殖可能是提前衰老的結(jié)果，這是一個(gè)重要的預(yù)防腫瘤發(fā)生的機(jī)制。最近的研究表明，ANRIL的表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌組織中上調(diào)，并與腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段和腫瘤大小顯著相關(guān)[19]。與這些研究相反，在多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤患者，9p21.3位點(diǎn)的rs2151280-T 等位基因與ANRIL的表達(dá)降低和叢狀纖維神經(jīng)瘤數(shù)量增多相關(guān)[20]。此外，黑色素細(xì)胞瘤相關(guān)變異子rs1011970-T 也與ANRIL表達(dá)的降低相關(guān)[9]。由于ANRIL的多種外顯子具有組織特異性，而既往研究針對(duì)的是不同的外顯子區(qū)域，使得對(duì)相關(guān)性的解釋較復(fù)雜。

3.2 ANRIL 在心血管疾病中的作用

ANRIL是9p21位點(diǎn)內(nèi)引起動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的首要候選基因，雖然其起促進(jìn)或抑制的作用尚存爭(zhēng)議[9-10]。GWAS 研究發(fā)現(xiàn)ANRIL 基因是冠心病和腹主動(dòng)脈瘤等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的遺傳易感位點(diǎn)[21]。后續(xù)研究證實(shí)了ANRIL 與這些疾病的聯(lián)系[8]，9p21區(qū)域內(nèi)與缺血性腦卒中和冠心病相關(guān)的SNPs位于ANRIL 基因[10]。一個(gè)大樣本研究分析了4個(gè)9p21區(qū)域的心血管疾病相關(guān)SNPs，發(fā)現(xiàn)冠心病危險(xiǎn)單倍型引起某些ANRIL 剪接子(EU741058 和NR_003529)表達(dá)升高，后者與動(dòng)脈粥樣硬化的程度一致[12]。亞洲印度人群的研究表明，9p21.3 冠心病危險(xiǎn)間隔的5個(gè)遺傳變異位點(diǎn)的CGGGG 單倍型具有較高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而GAAAA 單倍型則具有預(yù)防冠心病的作用。其中，rs2383206 與冠心病具有最強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，GG 基因型與ANRIL 轉(zhuǎn)錄子EU741058表達(dá)升高和p16表達(dá)降低相關(guān)[22]。一項(xiàng)對(duì)中國(guó)漢族人群腦卒中的隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，rs10757278 和rs10757274的GG 基因型與腦卒中(包括動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成、腔隙性梗死和腦出血，排除了栓塞性卒中和蛛網(wǎng)膜下腔出血)風(fēng)險(xiǎn)升高和復(fù)發(fā)有關(guān)。Rs10757278的GG 基因型與AA 基因型相比，MTAP、ANRIL 短轉(zhuǎn)錄子DQ485454 和EU741058 在粥樣硬化斑塊內(nèi)的表達(dá)顯著降低，而p16INK4a 和ANRIL 長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄子NR_003529表達(dá)升高[23]。此外，幾個(gè)小樣本的研究發(fā)現(xiàn)冠心病和腦卒中的危險(xiǎn)等位基因與ANRIL 降低的表達(dá)相關(guān)[8-9，11]。另有研究表明，ANRIL的5個(gè)相關(guān)SNPs與冠狀動(dòng)脈微血管功能有關(guān)[24]。ANRIL 可能參與動(dòng)脈粥樣硬化中的血栓形成、血管壁重建和修復(fù)和斑塊穩(wěn)定機(jī)制。ANRIL 可能通過調(diào)控CARD8 進(jìn)而增加缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[6]。Alu元件是靈長(zhǎng)類基因組特有的含量豐富的短散在重復(fù)序列，ANRIL 能通過轉(zhuǎn)錄子上的Alu 模體標(biāo)記靶基因的啟動(dòng)子從而反式調(diào)控，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制[3]。

動(dòng)物研究方面，人們建立了染色體4qC4/5位點(diǎn)70 ku 缺失的重組小鼠系，該區(qū)域與人9p21.3 上的58 ku 非編碼間隔同源，包含ANRIL的3'末端(Δ58:外顯子13-19)[5]。Chr4Δ70 kb/Δ70 kb小鼠的原代主動(dòng)脈SMCs表現(xiàn)出過度的增殖和減弱的老化，該過程能促進(jìn)冠心病的發(fā)生。小鼠體內(nèi)的CDKN2A 有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用，而MTAP 具有保護(hù)作用。MTAP-ANRIL 融合轉(zhuǎn)錄子在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用需要進(jìn)一步研究。

此外，ANRIL 也與非粥樣硬化性血管病如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)[25]。ANRL的這些與心血管疾病的關(guān)聯(lián)是獨(dú)立于大多數(shù)傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的，可能是一個(gè)新的病因[10]。

3.3 ANRIL 在其他疾病中的作用

GWAS表明ANRIL是2型糖尿病的遺傳易感位點(diǎn)，9p21區(qū)域糖尿病相關(guān)危險(xiǎn)變異子(rs10811661-T 和rs2383208-A)與ANRIL表達(dá)的下調(diào)相關(guān)[9]。此外，一些研究表明ANRIL的表達(dá)與牙周炎、骨髓纖維化、阿爾茨海默病、青光眼和子宮內(nèi)膜異位等多種疾病相關(guān)。

4 問題和展望

非編碼RNA 能通過多種機(jī)制介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控。關(guān)于短鏈非編RNAs 如microRNAs的研究已有大量報(bào)道。近年來，長(zhǎng)鏈非編碼RNAs 逐漸被發(fā)現(xiàn)是基因表達(dá)的重要調(diào)控子。其中，Chr9p21.3位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA ANRIL 在介導(dǎo)多種疾病中發(fā)揮重要作用。

雖然ANRIL 參與多種組織特異性表觀調(diào)控機(jī)制，但它的很多功能無法用現(xiàn)有的機(jī)制解釋。存在幾個(gè)主要問題:第一，ANRIL 參與眾多病因不相關(guān)的疾病的發(fā)生和發(fā)展，也參與移動(dòng)/黏附、增殖和死亡/凋亡等細(xì)胞過程，ANRI 通過怎樣的機(jī)制參與這些疾病，這些疾病又存在何種潛在關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究;第二，ANRIL 具有多種線性和環(huán)形同工型，發(fā)揮不同的生理作用，它們的作用方式、相互之間的聯(lián)系不清楚，既往的研究通過檢測(cè)少數(shù)幾個(gè)外顯子測(cè)定某種同工型的含量，可能混雜了其他同工型，今后的研究需更加特異、全面地測(cè)定并區(qū)分所有同工型;第三，ANRIL 擁有大量下游靶點(diǎn)，不僅調(diào)控臨近的CDKN2A/B 基因，也有獨(dú)立于CDKN2A/B的通路機(jī)制，其他通路需要進(jìn)一步的研究來揭示。此外，由于ANRIL 在嚙齒類動(dòng)物中不存在同源性，只能用人體細(xì)胞進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)，為研究帶來不便。

ANRIL是在不同水平和細(xì)胞類型中介導(dǎo)人類疾病的關(guān)鍵調(diào)控分子，目前它已經(jīng)成為一些腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化的生物標(biāo)記，其水平的高低反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度。隨著研究的進(jìn)展，ANRIL的作用機(jī)制將被進(jìn)一步揭示，未來有望成為治療人類疾病的新靶點(diǎn)。

[1]Pasmant E，Laurendeau I，Héron D，et al.Characterization of a germ-line deletion，including the entire INK4/ARF locus，in a melanoma-neural system tumor family:identification of ANRIL，an antisense noncoding RNA whose expression coclusters with ARF[J]Cancer Res，2007，67:3963-3969.

[2]He S，Gu W，Li Y，et al.ANRIL/CDKN2B-AS shows twostage clade-specific evolution and becomes conserved after transposon insertions in simians [J].BMC Evol Biol，2013，13:247.doi:10.1186/1471-2148-13-247.

[3]Holdt LM，Hoffmnn S，Sass K，et al.Alu elements in ANRIL non-coding RNA at chromosome 9p21 modulate atherogenic cell functions through trans-regulation of gene networks[J].PLoS Genet，2013，9:e1003588.doi:10.1371/journal.pgen.1003588.

[4]Burd CE，Jeck WR，Liu Y，et al.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk[J].PLoS Genetics， 2010， 6: e1001233.doi: 10.1371/journal.pgen.1001233.

[5]Visel A，Zhu Y，May D，et al.Targeted deletion of the 9p21 non-coding coronary artery disease risk interval in mice[J].Nature，2010，464:409-412.

[6]Bai Y，Nie S，Jiang G，et al.Regulation of CARD8 expression by ANRIL and association of CARD8 single nucleotide polymorphism rs2043211 (p.C10X)with ischemic stroke[J].Stroke，2014，45:383-388.

[7]Harismendy O，Notani D，Song X，et al.9p21 DNA variants associated with coronary artery disease impair interferon-γ signalling response [J].Nature，2011，470:264-268.

[8]Liu Y，Sanoff HK，Cho H，et al.INK4/ARF transcript expression is associated with chromosome 9p21 variants linked to atherosclerosis[J].PLoS One，2009，4(4):e5027.doi:10.1371/journal.pone.0005027.

[9]Cunnington MS，Santibanez KM，Mayosi BM，et al.Chromosome 9p21 SNPs associated with multiple disease phenotypes correlate with ANRIL expression[J].PLoS Genet，2010， 6 (4 ): e1000899.doi: 10.1371/journal.pgen.1000899.

[10]Broadbent HM，Peden JF，Lorkowski S，et al.Susceptibility to coronary artery disease and diabetes is encoded by distinct，tightly linked SNPs in the ANRIL locus on chromosome 9p[J].Human Mol Genet，2007，17:806-814.

[11]Congrains A，Kamide K，Oguro R，et al.Genetic variants at the 9p21 locus contribute to atherosclerosis through modulation of ANRIL and CDKN2A/B[J]Atherosclerosis，2012，220:449-455.

[12]Holdt LM，Beutner F，Scholz M，et al.ANRIL expression is associated with atherosclerosis risk at chromosome 9p21[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30:620-627.

[13]Wan G，Mathur R，Hu X，et al.Long non-coding RNA ANRIL (CDKN2B-AS)is induced by the ATM-E2F1 signaling pathway [J].Cell Signalling， 2013， 25:1086-1095.

[14]Zhang EB，Kong R，Yin DD，et al.Long noncoding RNA ANRIL indicates a poor prognosis of gastric cancer and promotes tumor growth by epigenetically silencing of miR-99a/miR-449a[J].Oncotarget，2014，5:2276-2292.

[15]Guil S，Soler M，Portela A，et al.Intronic RNAs mediate EZH2 regulation of epigenetic targets[J].Nat Struct Mol Biol，2012，19:664-670.

[16]Bei J，Li Y，Jia WH，et al.A genome-wide association study of nasopharyngeal carcinoma identifies three new susceptibility loci[J].Nat Genet，2010，42:599-603.

[17]Yu W，Gius D，Onyango P，et al.Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA [J].Nature，2008，451:202-206.

[18]Nie FQ，Sun M，Yang JS，et al.Long noncoding RNA ANRIL promotes non-small cell lung cancer cell proliferation and inhibits apoptosis by silencing KLF2 and P21 expression[J].Mol Cancer Ther，2015，14:268-277.

[19]Pasmant E，Sabbagh A，Masliah-Planchon J，et al.Role of noncoding RNA ANRIL in genesis of plexiform neurofibromas in neurofibromatosis type 1 [J].J Natl Cancer Inst，2011，103:1713-1722.

[20]Rodriguez C，Borgel J，Court F，et al.CTCF is a DNA methylation-sensitive positive regulator of the INK/ARF locus[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，392:129-134.

[21]Helgadottir A，Thorleifsson G，Magnusson KP，et al.The same sequence variant on 9p21 associates with myocardial infarction，abdominal aortic aneurysm and intracranial aneurysm[J].Nat Genet，2008，40:217-224.

[22]Shanker J，Arvind P，Jambunathan S，et al.Genetic analysis of the 9p21.3 CAD risk locus in Asian Indians[J].Thromb Haemost，2014，111:960-969.

[23]Zhang W，Chen Y，Liu P，et al.Variants on chromosome 9p21.3 correlated with ANRIL expression contribute to stroke risk and recurrence in a large prospective stroke population[J].Stroke，2011，43:14-21.

[24]Yoshino S，Cilluffo R，Best PJM，et al.Single nucleotide polymorphisms associated with abnormal coronary microvascular function[J].Coron Artery Dis，2014，25:281-289.

[25]Yasuno K，Bilguvaar K，Bjlnga P，et al.Genome-wide association study of intracranial aneurysm identifies three new risk loci[J].Nat Genet，2010，42:420-425.