惡性腫瘤外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

肖忠華，苗加偉

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，重慶 萬(wàn)州404120)

外泌體是多種活細(xì)胞主動(dòng)向胞外分泌的囊泡樣小體，直徑通常在40～100 nm，密度在1.10～1.18 g/mL，包含蛋白質(zhì)、RNA 和脂類等多種成分[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白與蛋白相互作用等蛋白質(zhì)組的特征，來(lái)獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)的一門科學(xué)。近年來(lái)，以腫瘤來(lái)源或與腫瘤相關(guān)的外泌體為研究對(duì)象，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)為研究工具，在闡明外泌體通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)血管新生和轉(zhuǎn)移等調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和發(fā)現(xiàn)腫瘤生物標(biāo)志物方面取得了一些進(jìn)步，為腫瘤臨床診療帶來(lái)了新的契機(jī)[2-3]。本文對(duì)來(lái)源于消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和其他系統(tǒng)的惡性腫瘤或與這些腫瘤相關(guān)的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)行歸納總結(jié)。

1 外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在消化系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用

1.1 胰腺導(dǎo)管癌

胰腺導(dǎo)管癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一。網(wǎng)蛋白是胰腺癌潛在的生物標(biāo)志物并在胰腺導(dǎo)管癌標(biāo)本中過(guò)表達(dá)，網(wǎng)蛋白(plectin)基因具有11個(gè)選擇性第一外顯子，其中8個(gè)可編碼，因而至少有8個(gè)變體，網(wǎng)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大于500 ku，廣泛表達(dá)于皮膚、肌肉和腦等各種組織中，但通常只定位于細(xì)胞質(zhì)[4-5]。胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞外泌體功能蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)表明:胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞膜表面經(jīng)外泌體分泌途徑過(guò)表達(dá)網(wǎng)蛋白，網(wǎng)蛋白表達(dá)依賴于整合素β4，網(wǎng)蛋白顯著影響外泌體蛋白質(zhì)組，并在細(xì)胞模型和大鼠移植瘤動(dòng)物模型試驗(yàn)中證實(shí)網(wǎng)蛋白1a 和1f 在抑制胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，提示網(wǎng)蛋白可能也是胰腺導(dǎo)管癌生物標(biāo)志物[6]。這一實(shí)驗(yàn)表明:惡性腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)外泌體分泌抑制惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白質(zhì)而存活，深入研究外泌體中高表達(dá)或低表達(dá)的蛋白質(zhì)可能發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，這些高或低表達(dá)的蛋白有可能成為惡性腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。

1.2 結(jié)腸直腸癌

結(jié)直腸癌細(xì)胞系外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究較多[7-12]。早期結(jié)直腸癌、隱形染色體家族性腺瘤樣息肉和大多數(shù)散發(fā)性結(jié)直腸癌中均發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因APC(adenomatous polyposis coli)突變。APC 基因編碼的APC蛋白參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)，APC 基因突變時(shí)，APC 基因編碼的蛋白不能與β-catenin/axin/CK1/GSK3β 形成降解復(fù)合物，β-catenin 聚集進(jìn)入胞核，與轉(zhuǎn)錄因子家族成員TCF/LEF 相互作用，促進(jìn)Wnt信號(hào)通路特定基因的表達(dá)，可能導(dǎo)致結(jié)腸直腸癌發(fā)生發(fā)展。在轉(zhuǎn)染APC 基因質(zhì)粒的SW480細(xì)胞和SW480 細(xì)胞分泌的外泌體蛋白質(zhì)組比較研究中，免疫雜交、半定量PCR 和免疫金電鏡證實(shí)阻黑體4(dickkopf-related protein 4，DKK4)高表達(dá)于轉(zhuǎn)染APC 質(zhì)粒的SW480 細(xì)胞外泌體中，甲基化特異PCR 分析表明:轉(zhuǎn)染APC 質(zhì)粒的SW480 細(xì)胞中DKK4 基因啟動(dòng)子甲基化水平降低，熒光定量PCR分析表明:DNMT-3a(DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3a)下調(diào)，提示結(jié)腸直腸上皮細(xì)胞可能通過(guò)下調(diào)DKK4 基因啟動(dòng)子甲基化，上調(diào)DKK4 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過(guò)外泌體分泌DKK4 誘導(dǎo)APC 基因突變、調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，促使結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展[7]。30%～40%結(jié)直腸癌細(xì)胞會(huì)發(fā)生K-RAS 突變，比較研究DLD-1 細(xì)胞的KRAS 野生型DKs-8 細(xì)胞和K-RAS突變型細(xì)胞DKO-1 細(xì)胞分泌的外泌體蛋白質(zhì)組表明:DKO-1 外泌體孵育的DKs-8 細(xì)胞不僅明顯增殖，而且侵襲能力得以增強(qiáng)[8-9]。以上實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體在維持結(jié)直腸癌細(xì)胞存活、增殖和侵襲微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。

2 外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用

2.1 腎細(xì)胞癌

腎細(xì)胞癌約占人惡性腫瘤3%，其發(fā)生率逐年上升。在一項(xiàng)比較研究來(lái)源于9例腎細(xì)胞癌患者混合尿外泌體和23例健康對(duì)照組的混合尿外泌體的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，患者混合尿外泌體中基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、血漿銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP)、足萼蛋白(podocalyxin，PODXL)、DKK4、碳酸酐酶Ⅸ(carbonic Anhydrase IX，CAIX)高表達(dá)，而水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer，EMMPRIN)、中性溶酶(neprilysin，CD10)、二肽酶1(dipeptidase 1)、多配體聚糖結(jié)合蛋白1(syntenin-1)低表達(dá)，以10個(gè)蛋白西方雜交試驗(yàn)結(jié)果制作的ROC 曲線AUC值在0.73～1 之間，提示同時(shí)應(yīng)用10個(gè)蛋白組成的外泌體蛋白質(zhì)組具有潛在的早期診斷腎細(xì)胞癌的臨床價(jià)值[13]，這表明惡性腫瘤外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究可能發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤潛在的早期診斷生物標(biāo)志物。

2.2 膀胱癌

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)僅次于前列腺癌的惡性腫瘤發(fā)生率。無(wú)轉(zhuǎn)移能力的膀胱癌T24 細(xì)胞、具大鼠肺組織和肝組織轉(zhuǎn)移能力的T24 等位基因SLT4 和FL3細(xì)胞株的外泌體蛋白質(zhì)組比較研究表明:波形蛋白、肝癌衍生生長(zhǎng)因子和酪蛋白激酶Ⅱα、膜朕蛋白A2 等與上皮間葉細(xì)胞移行相關(guān)蛋白質(zhì)只存在于兩株具轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞株外泌體中[14]，揭示惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體發(fā)揮著維系腫瘤細(xì)胞侵襲能力微環(huán)境的功能。

2.3 前列腺癌

前列腺癌是男性發(fā)病率高的惡性腫瘤。雄激素受體陽(yáng)性(AR+ve)細(xì)胞株VCaP、C4-2和LNCaP，RWPE-1 正常前列腺上皮細(xì)胞株，雄激素受體陰性(AR-ve)DU145細(xì)胞株等5種細(xì)胞的外泌體蛋白質(zhì)組比較研究結(jié)果顯示:四甲基羅丹明染色的具侵襲性前列腺癌DU145細(xì)胞外泌體分別與PC-3、VCap、LNCaP、C4-2和RWPE-1 細(xì)胞溫育過(guò)夜，共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DU145 外泌體不斷靠近上述細(xì)胞的細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，有趣的是細(xì)胞核周圍外泌體濃度最大的是RWPE-1 細(xì)胞株[15]，表明惡性腫瘤細(xì)胞外泌體可直接參與腫瘤細(xì)胞侵襲，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

2.4 卵巢癌

卵巢癌是致死率最高的婦產(chǎn)科腫瘤。外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)表明[16-17]:卵巢癌細(xì)胞外泌體富含與卵巢癌腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的整合素通路、EGF 受體通路、Wnt信號(hào)通路、PI3 激酶通路、FGF 受體信號(hào)、Ras、P53 和血管新生通路等蛋白，包括大量磷酸化、乙?；鞍?，而這些磷酸化、乙?；鞍自谡{(diào)節(jié)細(xì)胞與基質(zhì)之間的通訊方面起著重要作用。深入研究這些磷酸化蛋白、乙酰化蛋白等生物大分子之間的相互作用和其在信號(hào)傳導(dǎo)等通路中發(fā)揮的功能則有可能闡明惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子機(jī)制。

3 外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)在其他腫瘤中的應(yīng)用

外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究也應(yīng)用于乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞。在乳腺癌MCF-7 和MDA-MB231 細(xì)胞外泌體中的蛋白質(zhì)組比較研究中發(fā)現(xiàn)，MDA-231 外泌體包含更高水平的基質(zhì)金屬酶蛋白質(zhì)，這可能與MDA-231 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)相關(guān)[18]。人表皮黑素細(xì)胞HEMa-LP、NHEM-c和人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375、SK-MEL-28 外泌體蛋白質(zhì)組研究顯示，人表皮黑素細(xì)胞HEMa-LP、NHEM-c 分別與人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375 和SKMEL-28的外泌體孵育后，共聚焦顯微鏡顯示A375、SK-MEL-28 外泌體進(jìn)入到HEMa-LP、NHEM-c 細(xì)胞質(zhì)中，侵襲實(shí)驗(yàn)表明攝入A375、SK-MEL-28 外泌體的HEMa-LP、NHEM-c 增強(qiáng)了侵襲能力[19]。無(wú)侵襲能力人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞UW228 和DAOY細(xì)胞分別與來(lái)自具侵襲能力的人腦髓母細(xì)胞瘤D283MED細(xì)胞的外泌體孵育后，UW228 和DAOY細(xì)胞均顯著增強(qiáng)了增殖和遷移能力，遷移能力與外泌體濃度呈正相關(guān)[20]。這些研究進(jìn)一步證實(shí)惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體在維系腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移方面發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)語(yǔ)

從來(lái)源于惡性腫瘤的細(xì)胞培養(yǎng)液或與惡性腫瘤相關(guān)的體液中分離的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，腫瘤細(xì)胞來(lái)源或與之相關(guān)的外泌體在形成和維持腫瘤細(xì)胞存活、增殖和轉(zhuǎn)移侵襲的微環(huán)境，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮著重要作用[21]。然而，惡性腫瘤外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究還處于起步階段，尚不夠深入，如外泌體中蛋白質(zhì)的相互作用報(bào)道鮮見(jiàn)。可以預(yù)見(jiàn)，隨著外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，人們對(duì)外泌體，乃至整個(gè)細(xì)胞囊泡系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制將得以進(jìn)一步闡釋，外泌體臨床應(yīng)用將具有更良好的前景。

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