P-糖蛋白在腦損傷疾病中表達變化的研究進展

王德秀，王玉良

(濰坊醫(yī)學院 生理學教研室，山東 濰坊261053)

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP)是腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白家族中最早發(fā)現(xiàn)、研究得最為透徹的一種能量依賴性膜轉運蛋白。該蛋白最初從對秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發(fā)現(xiàn)[1]，隨后得到純化并于1985年首次克隆了其編碼基因MDR1[2]。由于P-GP 能清除進入細胞內的有害物質，因此P-GP在腦損傷疾病中的變化規(guī)律及其發(fā)揮功能的具體機制已成為當前的研究熱點。

1 P-GP 編碼基因與分子結構

MDR 可轉錄4.5 kb的mRNA，編碼分子質量為170 ka的P-GP。人類的MDR 基因包括MDR1 和MDR2，在嚙齒類動物中P-GP 由3個基因所編碼，即mdr1a，mdr1b 和mdr2，其中，MDR1 與mdr1a 和mdr1b 編碼的藥物轉運體大多與多藥耐藥有關，而MDR2和mdr2的編碼產(chǎn)物與多藥耐藥無關。

P-GP的一級結構由中間的連接區(qū)以及N端和C端2個同源功能區(qū)構成，其中每個功能區(qū)均包含6個跨膜結構域和1個胞質側的核苷酸結合結構域[3]。P-GP的二級結構由決定底物特異性有關的疏水結構域、2個物質運輸通道和2個ATP 結合位點組成。整個分子連續(xù)跨細胞膜12次，于胞質內側面形成兩個親水的環(huán)狀結構。

2 P-GP的體內分布與主要功能

P-GP 廣泛存在于生物體的正常組織，高表達于具有屏障和分泌功能的器官中，參與機體的分泌和解毒功能[4]。P-GP表達較多的部位是血-組織屏障，如:血腦屏障(blood brain barrier，BBB)、血睪丸屏障和血胎盤屏障[5]。生理情況下，P-GP 主要分布于肝、腎、胰腺和小腸等組織器官，在腦組織中，P-GP主要表達于BBB 毛細血管內皮細胞上，而在神經(jīng)元和膠質細胞上不存在表達[6]。體外研究顯示，P-GP在小膠質細胞和星形膠質細胞上也存在表達[7]。結果不同的原因可能是腦組織的固定條件不同，如在多聚甲醛固定的組織中P-GP 主要表達于星形膠質細胞，而在丙酮固定的腦組織中，P-GP則主要表達于血管內皮細胞和神經(jīng)元。

不同組織中的P-GP 具有不同的功能:1)定位在腸上皮細胞上的P-GP 通過限制藥物吸收而減少藥物進入體內的濃度;2)分布在血-組織屏障處的P-GP 將限制藥物進入一些較敏感的組織中，如大腦、睪丸和淋巴細胞;3)存在于肝細胞、膽小管上皮細胞側膜和腎近端小管頂膜上的P-GP 將進入血液循環(huán)中的藥物排泄入膽汁和尿液[8]。因此，P-GP在正常組織中的生理功能主要是將外源性物質排出至胞外，從而保護組織免受傷害。

3 P-GP在腦損傷疾病中的表達變化

3.1 癲癇損傷

癲癇狀態(tài)下，P-GP 不僅在腦血管內皮細胞上表達，而且在神經(jīng)元、星形膠質細胞及小膠質細胞等實質細胞中均可出現(xiàn)過表達的現(xiàn)象[9]。將腦微血管暴露在谷氨酸鹽中以模擬大鼠的癲癇狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在腦微血管內皮細胞上存在大量的P-GP。戊四氮點燃大鼠模型發(fā)現(xiàn)，P-GP在腦微血管內皮細胞以及海馬CA1區(qū)、齒狀回和皮質部位的神經(jīng)元上存在表達。在杏仁核點燃癲癇大鼠模型中，癲癇發(fā)作1周后在海馬區(qū)神經(jīng)元上也出現(xiàn)P-GP的表達[10]。在同樣模型中，可見P-GP在癲癇大鼠的皮質和海馬部位表達顯著增加[11]。以上結果提示，癲癇發(fā)作后，腦內P-GP表達具有明顯的區(qū)域特異性和細胞特異性，主要表現(xiàn)在海馬部位過量表達，且在內皮細胞上表達顯著，在神經(jīng)元、小膠質細胞以及星形膠質細胞的足突腔面也存在過表達。

表達時間上，在戊四氮點燃大鼠模型中，4 h后在海馬區(qū)、齒狀回以及皮質部位神經(jīng)元上出現(xiàn)P-GP的表達高峰。紅藻氨酸致癇大鼠模型中，大鼠癲癇2 h后，海馬錐體細胞和丘腦的神經(jīng)元上開始出現(xiàn)P-GP的陽性表達，6和24 h后，海馬錐體細胞P-GP表達最強烈，3 d后基本消失。海仁酸致癇大鼠24 h后，P-GP 主要在海馬CA3區(qū)、齒狀回、嗅周皮層以及杏仁核復合體上表達增加，而且主要定位在腦血管內皮細胞、少部分膠質細胞以及神經(jīng)元上[12]。提示癲癇發(fā)作24 h P-GP表達最強烈，這可能是癲癇發(fā)作24 h時，大腦缺血缺氧激活MDR 基因，使P-GP大量表達，發(fā)揮將細胞內的毒性物質排出胞外的作用[13]。

3.2 腦缺血/再灌注損傷

目前P-GP在腦內表達的研究主要集中在生理狀態(tài)下，腦缺血后P-GP的表達部位和表達水平研究報道不多。大腦中動脈永久閉塞模型(MCAO)大鼠腦缺血30 min后，皮層BBB 處微血管上即可出現(xiàn)P-GP表達，6 h后表達仍增加[14]。缺血1 d后，缺血周圍區(qū)的皮質及紋狀體內大量血管出現(xiàn)P-GP陽性表達，并隨時間延長而增加，3 d 達高峰[4]。在缺血15 d后，海馬CA1區(qū)微血管內皮細胞P-GP的表達水平降低，一直持續(xù)到30 d[15]?？梢?，在MCAO 永久閉塞模型的腦缺血早期(3 d 內)，皮質BBB 處的血管內皮細胞上最早出現(xiàn)P-GP的表達，繼而在缺血周圍區(qū)的皮質及紋狀體的血管上表達，這可能是早期腦缺血導致代謝廢物含量增多，使P-GP表達在短時間表現(xiàn)為升高;而在后期(15～30 d)，由于腦組織血管再生(建立側枝循環(huán))以及大腦本身的自我修復，細胞內的代謝廢物含量已經(jīng)下降，P-GP表達隨著這些傷害刺激減小而降低。

MCAO 缺血再灌注模型大鼠再灌注后2 h，可見BBB 處血管內皮細胞上的P-GP表達升高且持續(xù)到22 h[16]，在缺血損傷側皮質、紋狀體的血管內皮細胞和神經(jīng)元上也出現(xiàn)了P-GP的陽性表達，6 h 達到高峰，之后降低至24 h表達消失。采用短暫結扎雙側頸總動脈5min 建立腦缺血再灌注損傷模型，再灌注7 d 可見海馬區(qū)血管及膠質細胞上大量P-GP的陽性表達。本實驗室在雙側頸總動脈反復夾閉再通復制的血管性癡呆模型發(fā)現(xiàn)，缺血再灌后15 d，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元上出現(xiàn)P-GP的表達，30 d時表達明顯增多。這些結果提示缺血再灌注模型大鼠，再灌注早期在BBB 處血管內皮細胞、缺血損傷側皮質、紋狀體的血管內皮細胞和神經(jīng)元上都有P-GP的一過性表達;而再灌注后期(7 d 或更長時間)，可能由于繼發(fā)性缺血損傷對腦組織的損傷，導致海馬區(qū)神經(jīng)元上P-GP的大量表達。

在自發(fā)性高血壓大鼠中，遠端中腦和同側頸總動脈串聯(lián)閉塞，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析顯示，缺血1 h后大腦缺血半影區(qū)的P-GP表達下降[17]。同樣，大鼠腦缺血2 h 分別再灌15、30和60 min后，Western blot顯示缺血半球區(qū)的P-GP表達也顯著降低[18]，以上結果中P-GP表達水平差異的原因不清楚，可能是由于實驗采用的動物模型、研究方法、所觀察區(qū)域和抗體不同所致，而且這些結果多采用短期實驗，而對模擬血管性癡呆等慢性疾病的動物模型，腦內P-GP表達及相關指標的長期動態(tài)變化還需要進一步研究。

3.3 其他疾病腦損傷

研究發(fā)現(xiàn)，不同疾病條件下，BBB 上P-GP的表達是不同的，甚至是截然相反的。如在化療藥耐藥、癲癇(前面已論述)、精神病等情況下，患者腦內P-GP的表達較高，而在認知功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)變性病患者腦內P-GP的表達則明顯減少[19]。糖尿病大鼠BBB 上P-GP的表達量低，BBB的功能下降，大腦的內環(huán)境紊亂，這表明P-GP 可能與大鼠生存能力下降、智力減退有某種關系。還有實驗發(fā)現(xiàn)，體內的P-GP 活性隨年齡增長呈下降趨勢，這可能與變性病的發(fā)生有某種關系[20]。

4 展望

P-GP在體內廣泛表達，主要分布在腦內BBB的毛細血管內皮細胞、神經(jīng)元和膠質細胞上。作為膜上的轉運蛋白，P-GP 主要負責將細胞內的代謝廢物及外來的化學物質排出胞外，維持腦組織微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來，由于腦腫瘤和腦血管疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率不斷增加，P-GP的外排功能和作用機制研究越來越受重視，然而P-GP 發(fā)揮轉運功能的具體機制、不同疾病狀態(tài)下的表達情況以及與其他轉運蛋白和某些因子的相互作用尚未清楚，值得深入研究，這對于認識中樞神經(jīng)疾病的發(fā)病機制和新藥開發(fā)等具有重要意義。

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