AMD3100 體內(nèi)干預SDF-1/CXCR4 信號通路對關節(jié)軟骨組織退變的影響

李建 李彥林 王鑫 王國梁 何川 尤志敏 黃贊

昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院運動醫(yī)學科（昆明650032）

近期研究表明基質(zhì)細胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor-1, SDF-1)在骨關節(jié)炎（OA）患者軟骨退變的病理進程中起關鍵性作用[1-4]。 SDF-1 與軟骨組織表面的CXCR4 受體結合， 能激活細胞外信號調(diào)節(jié)酶（Erk）及相關激酶（p38MAP kinase）的信號通路，從而誘導軟骨組織基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1，3，9，13 的釋放，這些因子皆能誘導關節(jié)軟骨破壞[5-7]。我們前期采用AMD3100 進行體外實驗， 證實AMD3100 體外阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路后可抑制人關節(jié)軟骨組織分泌MMP-3，9，13 及減少II 型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖的降解，達到延緩軟骨退變的目的[8，9]。本研究進一步探討AMD3100 于體內(nèi)干預SDF-1/CXCR4 信號通路后延緩軟骨組織退變的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Hartley 豚鼠（上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司）；AMD3100（Sigma 公司，美國）；兔抗豚鼠IL-1 抗體、豚鼠抗TNF-α 多克隆抗體 （Abcom 公司）；Alzet 微量泵（北京拜安吉科技有限公司）； 病理切片機（Leica RM2135，德國）；番紅O ( Safranin O) （廣州展晨）；石蠟（上海華靈康復器械廠）； 顯微攝影系統(tǒng) （徠卡Leica DM4000B，德國）。

1.2 方法

取6 月齡雄性Hartley 豚鼠36 只隨機分成A、B、C 3 組， 每組12 只。 A 組為實驗組： 每只背部皮下植入Alzet 微量泵，內(nèi)含PBS 液稀釋過的AMD3100，每天以180 μg/ml 的濃度泵入；B 組為實驗對照組： 每只皮下植入Alzet 微量泵，內(nèi)含PBS 液；C 組為空白對照組：不做任何處理。

常規(guī)飼養(yǎng)12 周后，采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射處死所有Hartley 豚鼠后立即取下雙膝關節(jié)軟骨， 修剪成大小為3 mm × 3 mm × 1 mm 的軟骨組織塊，常規(guī)組織學檢測，行HE 染色及番紅染色。

采用Mankin 組織學評分以評價骨關節(jié)軟骨的退變程度。 Mankin 評分是一種反映骨關節(jié)炎中軟骨退變嚴重程度的方法，所得Mankin 評分分值越大，表明軟骨退變程度越嚴重。正常軟骨組織評分值為0 分，最高評分值為14 分。

采用免疫組化方法檢測Hartley 豚鼠軟骨組織中IL-1、TNF-α 的表達， 每張切片隨機取10 個視野（200倍）進行圖像分析。軟骨細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性表達。 用Image-Pro Plus 6.0 系統(tǒng)圖像分析儀進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)± 標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗， 檢驗水準α= 0.05，P ＜0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE 染色結果

實驗組關節(jié)軟骨的基本結構（表層、移行層、深層和軟骨基質(zhì)鈣化層）較清晰：表層有輕微增厚，軟骨細胞排列較緊密， 細胞核染色比較均勻， 軟骨面較為平整，細胞數(shù)目較多（圖1a）；而實驗對照組與空白對照組可見表層細胞脫落，移形層細胞梭形改變，深層和鈣化層細胞向外游離，軟骨細胞排列無序，軟骨面不平整，細胞核染色不均勻（圖1b，1c）。表明實驗組軟骨退變不明顯，實驗對照組和空白對照組的軟骨退變明顯。

圖1 各組組織學HE 染色觀察(×50)

2.2 番紅染色結果

實驗組番紅染色鮮紅（圖2a），而實驗對照組和空白對照組番紅染色較實驗組淡 （番紅染色將軟骨蛋白多糖染成紅色，膠原染成綠色），提示實驗對照組和空白對照組蛋白多糖含量明顯減少（圖2b，2c）。表明實驗組軟骨退變不明顯， 實驗對照組和空白對照組軟骨退變明顯。

圖2 各組番紅染色組織學觀察(×50)

2.3 Mankin 組織學評分

本實驗各組軟骨組織Mankin 組織學評分統(tǒng)計學分析結果表明： 實驗組較實驗對照組和空白對照組Mankin 組織學評分低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），見表1，說明實驗組軟骨退變程度較實驗對照組和空白對照組輕。

表1 各組軟骨Mankin 組織學評分結果（各組均n = 12）

2.4 軟骨組織內(nèi)IL-1、TNF-α 的表達

免疫組化結果：實驗組軟骨細胞排列較整齊，陽性細胞表達較少（圖3a，4a），而實驗對照組及空白對照組軟骨細胞排列不整齊，陽性細胞表達較多，并且可見明顯的“背靠背”現(xiàn)象及血管侵入(圖3b，3c；4b,4c)，表明實驗組較實驗對照組和空白對照組的IL-1、TNF-α 表達量低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 見表2、圖3、圖4。

表2 各組軟骨中IL-1、TNF-α 表達（各組均n = 12）

圖3 各組免疫組織化學染色觀察IL-1 的表達(×50)

圖4 各組免疫組織化學染色觀察TNF-α 的表達(×50)

3 討論

3.1 AMD3100 體內(nèi)干預SDF-1/CXCR4 信號通路后對軟骨組織退變的影響

我們前期采用OA 患者軟骨進行體外研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4 的特異性拮抗劑AMD3100 能與CXCR4 的第二胞外環(huán)狀區(qū)結合，與其疏水基團的殘基結合，能夠特異性阻斷CXCR4 與其配體SDF-1 的結合， 具有阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路的作用，從而抑制細胞外信號調(diào)節(jié)酶（Erk）及相關激酶（p38MAP kinase）的信號通路，減少基質(zhì)金屬蛋白酶3，9，13 的釋放，其中基質(zhì)金屬蛋白酶3 是聚集蛋白聚糖的特異性降解酶， 且激活的基質(zhì)金屬蛋白酶3 還能使其他基質(zhì)金屬蛋白酶激活， 特別是激活基質(zhì)金屬蛋白酶9 后能進一步引起Ⅱ型膠原的降解， 基質(zhì)金屬蛋白酶9 在中性環(huán)境下具有降解變性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的特異能力；基質(zhì)金屬蛋白酶13 是目前所知酶中最有效的Ⅱ型膠原降解酶。 由于基質(zhì)金屬蛋白酶3，9，13 的減少，使Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖降解減少，從而延緩關節(jié)軟骨組織退變[8，9]。

本實驗體內(nèi)給予AMD3100 后發(fā)現(xiàn)，實驗組較實驗對照組和空白對照組Mankin 組織學評分低，實驗組軟骨面較平整， 軟骨細胞排列較緊密， 細胞核染色較均勻，細胞數(shù)目較多，基本結構較清晰，軟骨蛋白多糖含量增多， 表明了實驗組較實驗對照組和空白對照組軟骨退變輕， 進一步提示AMD3100 在體內(nèi)可通過阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路， 抑制細胞外信號調(diào)節(jié)酶（Erk）及相關激酶（p38MAP kinase）的信號通路，減少基質(zhì)金屬蛋白酶3，9，13 的釋放，使Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖降解減少， 進而達到延緩關節(jié)軟骨組織退變的目的。本實驗也進一步說明SDF-1/CXCR4 信號通路可成為阻止關節(jié)軟骨退變的靶點， 這將為OA 的靶向治療提供實驗依據(jù)。

3.2 AMD3100 體內(nèi)干預SDF-1/CXCR4 信號通路對關節(jié)軟骨內(nèi)IL-1 和TNF-α 表達的影響

在正常情況下， 關節(jié)軟骨基質(zhì)的分解和合成代謝是通過分解性細胞因子和合成性細胞因子的平衡來維持的， 其中最重要的分解性細胞因子是IL-1、TNF-α，它們只有3%的同源性，IL-1 的生物活性比TNF-α 高100 倍，兩者作用于不同的受體，但表現(xiàn)出許多相似的生物學特性，例如它們能誘導和激活磷脂酶A2，活化花生四烯酸代謝途徑，促使PGE2 產(chǎn)生，加重關節(jié)炎癥反應，增加破骨細胞的活性，抑制軟骨細胞分裂和II 型前膠原mRNA 的表達、II 型膠原及蛋白多糖的合成，從而促進軟骨吸收，造成OA 的發(fā)生[10，11]。 研究證實在OA患者的關節(jié)液中，IL-1、TNF-α 等細胞因子的表達水平明顯升高， 其原因為IL-1、TNF-α 的基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)或增強子上均有核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的結合位點，而NF-κB 是介導OA 軟骨內(nèi)環(huán)境中的細胞因子對MMPs表達調(diào)控最重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 活化后可使宿主細胞IL-1、TNF-α 的基因轉(zhuǎn)錄增強， 使分解性細胞因子IL-1、TNF-α 的表達量升高[12]，升高的IL-1、TNF-α通過刺激軟骨細胞分泌MMP-1，3，9，13， 增加II 型膠原和聚集蛋白聚糖的剪切和降解，引起軟骨基質(zhì)降解，從而介導了OA 軟骨的破壞[13-15]。

本實驗發(fā)現(xiàn)實驗組較實驗對照組和空白對照組IL-1、TNF-α 表達量減少， 可能的原因為AMD3100 體內(nèi)干預SDF-1/CXCR4 信號通路后致使實驗組中軟骨組織退變輕并引起IL-1、TNF-α 表達量減少， 進一步減少了軟骨細胞分泌MMP-1，3，9，13， 減少II 型膠原和聚集蛋白聚糖的剪切和降解， 降低了軟骨基質(zhì)的分解代謝， 而AMD3100 具體如何通過SDF-1/CXCR4 信號通路使IL-1、TNF-α 在軟骨組織中表達量減少有待于進一步探討。

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