電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠體外循環(huán)后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的影響

涂 杰，梁東科，劉國(guó)鋒，劉菊梅，梁蓓薇，韋秋英，張炳東

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所手術(shù)麻醉室，廣西 南寧 530021)

電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠體外循環(huán)后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的影響

涂 杰，梁東科，劉國(guó)鋒，劉菊梅，梁蓓薇，韋秋英，張炳東

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所手術(shù)麻醉室，廣西 南寧 530021)

目的 探討電針(EA)內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠體外循環(huán)(CPB)后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)的影響。方法成年雄性SD大鼠75只，隨機(jī)分為五組(n=15)：假手術(shù)組(S組)、CPB組、CPB+EA組、CPB+蒼術(shù)苷組(CPB+Atr組)和CPB+EA+蒼術(shù)苷組(CPB+EA+Atr組)。采用尾動(dòng)脈插管灌注，右頸靜脈插管引流建立CPB模型。S組僅行麻醉和動(dòng)靜脈插管；CPB組行CPB 2 h；CPB+EA組行CPB 2 h且在CPB期間使用電針刺激雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴；CPB+Atr組在CPB開(kāi)始時(shí)靜脈注射蒼術(shù)苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB組；CPB+EA+Atr組在CPB開(kāi)始時(shí)靜脈注射蒼術(shù)苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB+EA組。麻醉復(fù)蘇后2 h，取右股動(dòng)脈血測(cè)定心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性；取左心室心肌組織，電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，行線粒體損傷評(píng)分，并用差速離心法分離線粒體，測(cè)定線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性。結(jié)果與S組比較，其余各組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷較重，線粒體損傷評(píng)分增加，線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)；與CPB組比較，CPB+EA組和CPB+EA+Atr組cTnI濃度和CK-MB活性降低，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷較輕，線粒體損傷評(píng)分下降，線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性降低(P＜0.05)。蒼術(shù)苷可抑制電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌的保護(hù)作用(P＜0.05)。結(jié)論電針內(nèi)關(guān)穴可減輕大鼠體外循環(huán)后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制可能與抑制線粒體內(nèi)鈣超載和減少M(fèi)PTP的開(kāi)放有關(guān)。

電針；內(nèi)關(guān)穴；體外循環(huán)；線粒體損傷；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass,CPB)過(guò)程中手術(shù)操作引起的直接損傷、循環(huán)管路與血液接觸激活的全身炎癥反應(yīng)以及心臟停跳復(fù)跳所致的缺血再灌注損傷等因素，均可導(dǎo)致術(shù)后發(fā)生不同程度的心肌損傷[1]。內(nèi)關(guān)穴屬手厥陰心包經(jīng)，素有“內(nèi)關(guān)主刺氣快攻，兼炙心胸肋痛疼”的古訓(xùn)，大量基礎(chǔ)和臨床研究[2-4]證實(shí)電針(Electroacupuncture，EA)內(nèi)關(guān)穴具有明顯的心肌保護(hù)作用，但其具體機(jī)制仍不清楚。本研究擬觀察電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠體外循環(huán)后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的影響，并初步探討其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 多功能監(jiān)測(cè)儀(日本光電公司)，動(dòng)物膜式氧合器(東莞科威醫(yī)療器械有限公司)，雙頭滾壓泵(德國(guó)Stockert公司)，多用電子穴位治療儀(上海華誼儀器公司)，透射電鏡(日本JEOL公司)，紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，線粒體提取試劑盒(南京建成生物工程研究所)，二氨基聯(lián)苯胺蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蒼術(shù)苷(Sigma公司，美國(guó))，Ca2+濃度試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。清潔級(jí)健康雄性SD大鼠75只，4～6個(gè)月齡，體重320～420 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將75只大鼠隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組(S組)、CPB組、CPB+ EA組、CPB+蒼術(shù)苷組(CPB+Atr組)和CPB+EA+蒼術(shù)苷組(CPB+EA+Atr組)，每組15只。S組僅于麻醉誘導(dǎo)后行機(jī)械通氣和各部位插管，不行CPB；CPB組行CPB 2 h；CPB+EA組行CPB 2 h，且在CPB期間使用電針刺激雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴；CPB+Atr組在CPB開(kāi)始時(shí)靜脈注射蒼術(shù)苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB組；CPB+ EA+Atr組在CPB開(kāi)始時(shí)靜脈注射蒼術(shù)苷5 mg/kg，隨后處理方法同CPB+EA組。

1.3 CPB模型制備 參照文獻(xiàn)[5]制作大鼠體外循環(huán)模型。腹腔注射10%烏拉坦10 ml/kg麻醉，16 G靜脈導(dǎo)管行氣管插管后機(jī)械通氣，潮氣量3 ml/kg，呼吸頻率60次/min。經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入雙腔球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(球囊直徑3.5 mm)至大鼠升主動(dòng)脈根部，以備主動(dòng)脈阻斷和心肌停跳液灌注。采用尾動(dòng)脈插管灌注，右頸靜脈插管引流建立CPB。無(wú)血預(yù)充，灌注流量約為每分鐘100 ml/kg。CPB開(kāi)始后即逐漸降溫，15 min后大鼠鼻溫接近32℃，充氣升主動(dòng)脈內(nèi)雙腔球囊擴(kuò)張導(dǎo)管套囊，阻斷升主動(dòng)脈，并灌注St.ThomasⅡ型心肌停跳液15 ml/kg，使心臟停跳。在心臟停跳15 min后逐漸復(fù)溫，并于心臟停跳30 min時(shí)套囊放氣，開(kāi)放升主動(dòng)脈，恢復(fù)心臟供血，以使心臟復(fù)跳。CPB轉(zhuǎn)流2 h后逐漸減少灌注流量，在心率血壓穩(wěn)定的情況下結(jié)束體外循環(huán)。待自主呼吸恢復(fù)平穩(wěn)后停止機(jī)械通氣，拔除氣管導(dǎo)管，并密切觀察大鼠麻醉復(fù)蘇后生命體征，2 h后頸椎脫臼處死大鼠。

1.4 電針?lè)椒?內(nèi)關(guān)穴定位參考文獻(xiàn)[2]，位于尺橈骨縫間，距腕關(guān)節(jié)約3 mm處。在CPB開(kāi)始后，取大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，用0.3 mm×15 mm毫針刺入皮下2 mm，接電針儀，疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，強(qiáng)度1 mA，CPB結(jié)束時(shí)拔針。

1.5 血漿心肌肌鈣蛋白I(cTnI)濃度和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的檢測(cè) 麻醉復(fù)蘇后2 h，從大鼠右股動(dòng)脈插管處取血，離心，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)cTnI濃度和CK-MB活性。

1.6 電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和心肌線粒體損傷評(píng)分 麻醉復(fù)蘇后2 h，將大鼠頸椎脫臼處死，剖胸取左心室心肌組織，固定包埋切片后，于透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，并行心肌線粒體損傷評(píng)分，評(píng)分方法參考文獻(xiàn)[6]。

1.7 線粒體內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè) 用差速離心法提取心肌線粒體后，將線粒體用20倍的預(yù)冷勻漿溶液制成混懸液，按照Ca2+試劑盒的使用說(shuō)明，用比色法測(cè)定Ca2+濃度。

1.8 線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)活性測(cè)定 參照J(rèn)ie等[7]的方法，用紫外分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定線粒體混懸液在540 nm處的吸光值，每30 s測(cè)定1次，持續(xù)6 min。以第1次測(cè)定值為參照值，其余時(shí)點(diǎn)的測(cè)定值與之相比，所得比值即為相對(duì)吸光度值(A540)，用最大A540值與最小A540值的差值表示MPTP活性，從而反映其開(kāi)放水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 S組大鼠全部順利完成試驗(yàn)；CPB組有2只大鼠因CPB后心功能衰竭死亡；CPB+ EA組有1只大鼠因CPB后心律失常死亡;CPB+Atr組有1只大鼠因心臟復(fù)跳失敗死亡；CPB+EA+Atr組有1只大鼠因CPB后心功能衰竭死亡，1只大鼠因心臟復(fù)跳失敗死亡。

2.2 各組大鼠血漿cTnI濃度和CK-MB活性的比較 與S組比較，其余各組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高(P＜0.05)；與CPB組比較，CPB+EA組和CPB+EA+Atr組cTnI濃度和CK-MB活性下降(P＜0.05)，CPB+Atr組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高(P＜0.05)；與CPB+EA組比較，CPB+EA+Atr組 cTnI濃度和CK-MB活性升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察 S組心肌纖維排列規(guī)整，各帶明顯，各細(xì)胞器未見(jiàn)異常；CPB組心肌纖維排列紊亂，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清，線粒體腫脹，內(nèi)有空泡形成，嵴斷裂；CPB+EA組心肌纖維排列略紊亂，線粒體輕微腫脹，少量嵴斷裂。CPB+Atr組心肌纖維排列明顯紊亂，線粒體明顯腫脹，內(nèi)有大量空泡形成，嵴丟失；CPB+EA+Atr組心肌纖維排列紊亂，線粒體略水腫，峭斷裂，見(jiàn)圖1。

2.4 各組大鼠線粒體損傷評(píng)分、線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性的比較 與S組比較，其余各組線粒體損傷評(píng)分增加，線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)；與CPB組比較，CPB+EA組和CPB+EA+ Atr組線粒體損傷評(píng)分下降，線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性降低(P＜0.05)，CPB+Atr組線粒體損傷評(píng)分增加，線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)；與CPB+EA組比較，CPB+EA+Atr組線粒體損傷評(píng)分增加，線粒體內(nèi)Ca2+濃度和MPTP活性升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠cTnI、CK-MB、線粒體損傷評(píng)分、Ca2+濃度和MPTP活性的比較(±s)

表1 各組大鼠cTnI、CK-MB、線粒體損傷評(píng)分、Ca2+濃度和MPTP活性的比較(±s)

注：與S組比較，aP＜0.05；與CPB組比較，bP＜0.05;與CPB+EA組比較，cP＜0.05。

S組CPB組CPB+EA組CPB+Atr組CPB+EA+Atr組F值P值0.042±0.009 0.092±0.026a0.050±0.013ab0.097±0.022ab0.062±0.017abc4.231 0.000 20 18 19 19 18 0.02±0.01 4.73±0.67a1.58±0.26ab4.86±0.73ab2.85±0.33abc17.661 0.000 11.7±2.4 57.3±13.7a32.7±11.3ab62.6±14.2ab43.8±12.5abc28.125 0.000 0.73±0.20 2.88±0.85a1.46±0.53ab3.17±0.86ab1.82±0.64abc8.424 0.000 0.51±0.08 4.84±1.26a2.68±1.13ab5.33±1.47ab3.47±1.06abc12.253 0.000

圖1 各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的觀察(醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，×20 000)

3 討 論

本研究采用尾動(dòng)脈插管灌注，右頸靜脈插管引流的方法建立大鼠CPB模型，實(shí)現(xiàn)了接近生理的全流量灌注，同時(shí)經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入雙腔球囊擴(kuò)張導(dǎo)管至升主動(dòng)脈根部，充氣阻斷主動(dòng)脈，灌注心肌停跳液使心臟停跳，從而在最大程度上模擬了CPB造成的心肌缺血再灌注損傷，為研究心臟手術(shù)中心肌損傷提供了可靠的動(dòng)物模型。大量基礎(chǔ)和臨床研究[2-4]證實(shí)電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，因此本研究選用內(nèi)關(guān)穴作為刺激穴位，內(nèi)關(guān)穴的定位和刺激方法參照文獻(xiàn)[2]。蒼術(shù)苷是MPTP特異性開(kāi)放劑，本研究參照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)[8]，選擇在CPB開(kāi)始時(shí)靜脈注射蒼術(shù)苷5 mg/kg。

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化可直接反映心肌細(xì)胞損傷的程度[9]。當(dāng)心肌發(fā)生缺血缺氧性損傷時(shí)，其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)可發(fā)生改變，以線粒體的改變最為顯著，表現(xiàn)為線粒體水腫、峭斷裂和空泡化等，Dadabayev等[10]認(rèn)為維持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，是心肌細(xì)胞能量代謝順利進(jìn)行的最基本條件。本研究發(fā)現(xiàn)，與S組比較，CPB組和CPB+EA組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，但CPB+EA組心肌線粒體損傷評(píng)分均明顯低于CPB組，從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了電針內(nèi)關(guān)穴可保持心肌線粒體膜和空間結(jié)構(gòu)的完整性，有利于減輕CPB后心肌細(xì)胞的損傷。

cTnI和CK-MB是評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞損傷程度的常用指標(biāo)，有較高的特異性和敏感性[11]。本研究結(jié)果表明，與S組比較，CPB組和CPB+EA組cTnI濃度和CK-MB活性明顯升高，說(shuō)明CBP可造成一定程度的心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與體外循環(huán)管路和血液接觸激活的全身炎性反應(yīng)、心臟停跳復(fù)跳所致的心肌缺血再灌注損傷等因素有關(guān)；而CPB+EA組cTnI濃度和CK-MB活性明顯低于CPB組，從分子生物學(xué)上證實(shí)了電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)大鼠CBP后的心肌保護(hù)作用是明顯的。

線粒體不僅是細(xì)胞的能量代謝中心，同時(shí)也是細(xì)胞Ca2+的緩沖器，具有攝取和釋放Ca2+的能力，對(duì)維持胞漿內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)起重要作用[10]。CPB所致的全身炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和缺血再灌注損傷等傷害性因素，可引起細(xì)胞膜上的Ca2+通道蛋白變構(gòu)，使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致胞漿內(nèi)鈣超載；胞漿內(nèi)高濃度的Ca2+使線粒體攝取Ca2+增加，導(dǎo)致線粒體內(nèi)形成磷酸鈣沉積，引起氧化磷酸化過(guò)程障礙，細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞損傷發(fā)生[12]。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，CPB組和CPB+EA組線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，說(shuō)明大鼠CPB后線粒體內(nèi)發(fā)生了鈣超載，這與Drabek等[13]研究一致。而CPB+EA組線粒體內(nèi)Ca2+濃度明顯低于CPB組，提示電針內(nèi)關(guān)穴的心肌保護(hù)作用可能與抑制線粒體內(nèi)鈣超載有關(guān)。

近年有研究表明線粒體凋亡是CPB后心肌細(xì)胞損傷的最主要形式，而線粒體凋亡通路的分子基礎(chǔ)是MPTP的開(kāi)放[12]。MPTP是位于線粒體膜上的多蛋白復(fù)合體，在維持線粒體膜電位、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用[14]。生理狀態(tài)下，MPTP關(guān)閉，當(dāng)受到傷害性因素刺激時(shí)(如缺血缺氧、氧化應(yīng)激等)，MPTP異常開(kāi)放，大量水和無(wú)機(jī)離子進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡化，同時(shí)細(xì)胞色素C通過(guò)MPTP釋放到胞漿中，激活一系列凋亡蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。因此，大量研究已將抑制MPTP的開(kāi)放作為心肌保護(hù)中的新策略。本研究發(fā)現(xiàn)，CPB+EA組心肌細(xì)胞MPTP的開(kāi)放程度明顯低于CPB組，但是，與CPB+EA組比較，CPB+EA+Atr組血漿cTnI濃度和CK-MB活性升高，心肌線粒體損傷評(píng)分增加，表明給予MPTP特異性開(kāi)放劑蒼術(shù)苷后，電針內(nèi)關(guān)穴的心肌保護(hù)作用被拮抗，因而，我們推測(cè)電針內(nèi)關(guān)穴的心肌保護(hù)作用還可能與減少M(fèi)PTP的開(kāi)放程度有關(guān)。

綜上所述，電針內(nèi)關(guān)穴可減輕大鼠體外循環(huán)后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制可能與抑制線粒體內(nèi)鈣超載和減少M(fèi)PTP的開(kāi)放有關(guān)，其臨床應(yīng)用前景可觀。

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Effect of electroacupuncture at Neiguan point on myocardial ultrastructure and mitochondrial permeability transition pore in rats undergoing cardiopulmonary bypass.

TU Jie,LIANG Dong-ke,LIU Guo-feng,LIU Ju-mei, LIANG Bei-wei,WEI Qiu-ying,ZHANG Bing-dong.Operation&Anesthesia Room,Institute of Cardiovascular Disease, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture at Neiguan point(EA)on myocardial ultrastructure and mitochondrial permeability transition pore(MPTP)in rats undergoing cardiopulmonary bypass (CPB).MethodsSeventy-five adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=15 each): sham operation group(group S),group CPB,group CPB+EA,CPB+infuse atractyloside group(group CPB+Atr),and CPB+EA+infuse atractyloside group(group CPB+EA+Atr).Tail arteries and right jugular vein were cannulated for CPB.Rats in group S were anaesthetized and cannulated;rats in group CPB were subjected to CPB for 2 h;rats in group CPB+EA were subjected to CPB for 2 h and electro-acupunctured at Neiguan point during CPB;rats in group CPB+Atr and group CPB+EA+Atr were infused atractyloside 5 mg/kg at the beginning of CPB.Blood samples were taken from right femoral artery at 2 h after anesthesia resuscitation for determination of plasma cardiac troponin I(cT-nI)concentration and creatine kinase-MB(CK-MB)activity,and those animals were sacrificed to obtain the myocardial specimens from left ventricle.Electron microscope was used to observe the changes of mitochondrial ultrastructure, and the severity of mitochondria injury was scored.Mitochondria fractions were isolated by differential centrifugation to test the concentration of Ca2+and MPTP opening degree.ResultsCompared with group S,the plasma concentrations of cTnI and activity of CK-MB were significantly higher,the damage of myocardial ultrastructure was aggravated,the score of mitochondrial injury,the concentration of Ca2+in mitochondrial and MPTP opening degree were significantly increased in other four groups(P＜0.05).Compared with group CPB,the plasma concentrations of cTnI and activity of CK-MB were significantly lower,the damage of myocardial ultrastructure was attenuated,the score of mitochondrial injury,the concentration of Ca2+in mitochondrial and MPTP opening degree were significantly decreased ingroup CPB+EA and group CPB+EA+Atr(P＜0.05).However,the protective effects of EA were inhibited by atractyloside(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture at Neiguan point can reduce the damage of myocardial ultrastructure in rats undergoing CPB.The mechanism is closely related to inhibiting calcium overload in mitochondrial and decreasing MPTP opening.

Electroacupuncture;Neiguan;Cardiopulmonary bypass(CPB);Mitochondrial damage;Mitochondrial permeability transition pore(MPTP)

R-332

A

1003—6350（2015）10—1405—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.10.0504

2014-12-01)

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金(編號(hào)：2013GXNSFBA019124)

張炳東。E-mail：zbdong2007@163.com