DPDmRNA及TSmRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者含替吉奧方案的化療臨床預(yù)后的關(guān)系

練 煉，慎曉明，周 沖，李 偉，陶 敏

（1.蘇州市相城人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215131，2.徐州市中心醫(yī)院放療科，江蘇 徐州 221009；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215006）

DPDmRNA及TSmRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者含替吉奧方案的化療臨床預(yù)后的關(guān)系

練 煉1，慎曉明1，周 沖2，李 偉3，陶 敏3

（1.蘇州市相城人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215131，2.徐州市中心醫(yī)院放療科，江蘇 徐州 221009；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215006）

目的 探討二氫嘧啶脫氫酶(Thymidine phosphorylase，DPD)mRNA及胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS)mRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者含替吉奧方案的化療臨床預(yù)后的關(guān)系。方法經(jīng)病理學(xué)確診的進(jìn)展期胃癌患者40例，化療前抽取外周血采用RT-PCR法檢測DPDmRNA及TSmRNA表達(dá)水平，給予含替吉奧的方案：替吉奧+順鉑化療。分析DPDmRNA及TSmRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者含替吉奧方案的化療臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果40例進(jìn)展期胃癌患者中，至隨訪結(jié)束，40例患者中位OS為13.5個月，其中DPD低表達(dá)者為17個月，DPD高表達(dá)者為10個月，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.059，P=0.044)。TS低表達(dá)者為17個月，TS高表達(dá)者為10個月，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.936，P=0.047)。聯(lián)合分析顯示，DPD低表達(dá)且TS低表達(dá)的患者表現(xiàn)出更長的OS(χ2=17.486，P=0.001)。結(jié)論DPDmRNA及TSmRNA表達(dá)可單獨(dú)或聯(lián)合用于預(yù)測進(jìn)展期胃癌患者對含替吉奧方案的預(yù)后。

DPD；TS；進(jìn)展期胃癌；替吉奧

化療目前仍是進(jìn)展期胃癌的主要治療手段。目前的研究表明化療與最佳支持治療相比，可明顯改善進(jìn)展期胃癌患者的生活質(zhì)量，延長生存期。目前胃癌最常采用的化療藥物主要包括5-FU類、蒽環(huán)類、鉑類和紫杉類、拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑等。其中5-氟尿嘧啶類藥物一直是胃癌化療的基礎(chǔ)用藥。

二氫嘧啶脫氫酶(Thymidine phosphorylase，DPD)及胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS)是5-FU代謝過程中的兩個關(guān)鍵酶。二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-FU類化療藥物的分解代謝的起始酶和限速酶。而胸苷酸合成酶(TS)是5-FU藥物作用的靶酶。DPD決定了體內(nèi)5-FU的有效濃度，而TS則決定5-FU藥物化療的敏感性[1]。但是5-FU臨床使用時需靜脈泵入，具有給藥時間長、化療毒性大等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。

替吉奧是第三代氟脲嘧啶衍生物的口服制劑。替吉奧代謝后在血液中產(chǎn)生5-Fu的持續(xù)時間較長，其半衰期為(13.1±3.1)h，從而取得了與5-Fu持續(xù)靜注類似的效果。替吉奧中OXO能夠特異性抑制腸道黏膜細(xì)胞內(nèi)乳清酸核糖轉(zhuǎn)移酶的活性，阻斷5-Fu的磷酸化，從而減輕胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。由于替吉奧進(jìn)入中國市場的時間不長，目前中國尚無有關(guān)二氫嘧啶脫氫酶(DPD)及胸苷酸合成酶(TS)與含替吉奧的方案的化療預(yù)后研究方面的報道。故深入研究進(jìn)展期胃癌患者的DPD mRNA及TS mRNA表達(dá)水平與含替吉奧方案化療預(yù)后的關(guān)系具有重要的現(xiàn)實意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年6月至2011年6月期間在蘇州市相城人民醫(yī)院就診，經(jīng)病理學(xué)確診的進(jìn)展期胃癌患者40例，其中男26例，女14例，年齡45～78歲，中位年齡66.5歲。研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織或細(xì)胞學(xué)證實的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃癌。年齡大于18歲；體力狀態(tài)：KPS評分≥70分；預(yù)期生存期≥3個月；未接受過抗腫瘤治療或術(shù)后輔助化療，且距末次化療6個月以上；目標(biāo)病灶放療者需要放療結(jié)束后至少3個月；至少有一個可測量病灶(CT、MR的病灶面積至少10 mm×10 mm)；實驗室檢查結(jié)果：白細(xì)胞(WBC)≥4.0×109/L，中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC)≥1.5×109/L，血小板(PLT)≥100×109/L。血清膽紅素≤正常值上限，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)在無肝轉(zhuǎn)移情況下應(yīng)≤正常值上限×2.5，如有肝轉(zhuǎn)移≤正常值上限×5；尿素氮≤正常值上限×1.25，肌酐≤正常值上限×1.25。所有患者均在治療前簽署倫理之情同意書。

1.2 化療方案及生存隨訪 含替吉奧的化療方案：替吉奧+順鉑。替吉奧(維康達(dá)，魯南制藥集團(tuán)山東新時代藥業(yè)有限公司生產(chǎn))用法：40 mg/m2，bid，d1～14，PO；順鉑用法：75 mg/m2，Ivgtt，d1，21 d為一個周期。隨訪采用門診隨訪與電話隨訪相結(jié)合，終點(diǎn)為死亡，截止日期為2014年6月。隨訪時間截止時仍存活或失訪的作為截尾數(shù)據(jù)?？偵嫫?Overall survival，OS)規(guī)定為從疾病診斷日到死亡時間或者隨訪截止時間，隨訪36個月。

1.3 外周血中DPD mRNA及TS mRNA的檢測方法

1.3.1 實驗標(biāo)本 抽取患者外周血約7 ml，用EDTA-Na2抗凝，抽取mRNA并保存于-80℃冰箱中待測。

1.3.2 試劑和引物設(shè)計 Trizol(Invitrogen公司，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen公司，上海)，PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工，上海)，引物由primer premier5.0軟件系統(tǒng)設(shè)計，引物序列如下：TS引物序列：5'-CTTCAGC GAGAACCCAGACC-3'，5'-TCCAGCCAACCCCTAAAGAC-3'，PCR產(chǎn)物長度192 bp；DPD引物序列：5'-AAACCAGTTCCACGTATAGC-3'，5'-AAACCAG TTCCACGTATAGC-3'，PCR產(chǎn)物長度501 bp。GAPDH引物序列：5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，5'-TGAGTCCTTCCAC-GATACC-3'，PCR產(chǎn)物長度為308 bp。

1.3.3 細(xì)胞總RNA的提取 在無菌條件下，將抗凝血用Ficoll-Hypaque法分離出有核細(xì)胞，用DEPC處理過的PBS液洗滌兩次，然后取5×106細(xì)胞移入1.5 ml離心管中，再加1 ml Trizol，充分混勻，靜置5 min后加入0.2 ml氯仿混勻，使用離心機(jī)在4℃、12 000 r/min離心15 min，將上清移入另一離心管中，加等體積異丙醇充分混勻，再使用離心機(jī)在4℃，12 000 r/min，離心15 min，棄去上清液，加1 ml用DEPC水配制成的75%乙醇洗滌。

1.3.4 cDNA合成 取0.5 ml容量離心管，置于冰浴上，加入10×反應(yīng)緩沖液2 μl，用RNA酶抑制劑10 U，及10 mmol/L的dNTP混合物2 μl，再用Oligo (dT)180.5 mmol/L加入1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(4個單位)，加無RNA酶去離子水定容至20 μl，充分混勻，加入總RNA 50 ng～2 μg，混勻后離心3～5 s，放入42℃水浴1 h，在70℃水浴中10 min，轉(zhuǎn)于冰上冷卻，然后放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錅y。

1.3.5 RT-PCR PCR的反應(yīng)體系為25 μl，其中cDNA為1 μl，10×PCR緩沖液(Mg2+Plus)為2.5 μl，TaqDNA聚合酶為0.1 μl，4種dNTP混合物為2 μl，上下游引物各為1 μl，再用無RNA酶去離子水定容至25 μl。以β-actin為內(nèi)參，然后與目的基因同管擴(kuò)增。具體反應(yīng)條件：95℃中預(yù)變性1 min，接著行40個循環(huán)，條件為：95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30 s，最后72℃延伸10 min，最后于4℃保存。

1.3.6 PCR產(chǎn)物分析 使用厚度為4 mm的1%的瓊脂糖凝膠(含EB 0.01 g/ml)，上樣擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，電壓設(shè)為90 V/cm，電泳時間20 min，以2 000 bp的DNA Marker作為對照，利用培清凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析PCR產(chǎn)物。使用Bio-Rad公司的Quantity One軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析，用以判斷目的基因的相對表達(dá)量，并且對PCR產(chǎn)物測序以證實其特異性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)各組基因表達(dá)的平均數(shù)值將每組患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。生存率的計算采用Kaplan-Meier方法，兩組之間的生存差異使用Log-rank檢驗。取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者特征 共有40例患者符合入選標(biāo)準(zhǔn)。患者的平均身體表面積為1.56 m2(范圍：1.23～1.98 m2)。21例患者(52.5%)化療前接受過胃大部切除術(shù)。腹腔淋巴結(jié)、肝轉(zhuǎn)移灶為主要的可評價病灶。胃原發(fā)病灶及腹水為主要的不可評價病灶。使用RT-PCR法檢測的40例患者的DPD mRNA和TS mRNA表達(dá)相對于β-actin的相對數(shù)值分別為(2.53±1.86)和(0.636±0.363)。取DPD和TS mRNA相對表達(dá)量分別以大于2.53和0.636為高表達(dá)。

2.2 DPD及TS mRNA表達(dá)與生存的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線顯示DPD及TS mRNA表達(dá)與OS的關(guān)系。40例患者中位OS為13.5個月，其中DPD低表達(dá)者為17個月，DPD mRNA高表達(dá)者為10個月，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.059，P=0.044)。TS mRNA低表達(dá)者為17個月，TS高表達(dá)者為10個月，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.936，P=0.047)。聯(lián)合分析顯示，DPD低表達(dá)且TS mRNA低表達(dá)的患者表現(xiàn)出更長的OS(χ2=17.486，P=0.001)，見圖1。

圖1 DPD及TSmRNA的表達(dá)與總生存期（OS）之間的關(guān)系

3 討論

近年來，基于大量藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)方面的研究成果，已使腫瘤的個體化治療在臨床上的應(yīng)用成為可能。由于傳統(tǒng)的臨床的參數(shù)和傳統(tǒng)腫瘤組織病理學(xué)特征已經(jīng)不再適合指導(dǎo)治療方案的制定。通過腫瘤的個體化治療提高療效，減少無效藥物毒副反應(yīng)是臨床腫瘤學(xué)追求的目標(biāo)。相關(guān)腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些腫瘤特異性分子可以作為預(yù)測腫瘤患者預(yù)后的標(biāo)志物[3]。

DPD是嘧啶類藥物分解代謝的起始和限速酶Toriumi的研究發(fā)現(xiàn)DPD mRNA的表達(dá)水平與晚期胃癌患者的預(yù)后有顯著相關(guān)性[4]。Matsubara等[5]的研究顯示：DPD mRNA高表達(dá)是進(jìn)展期胃癌的不良預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)DPD mRNA低表達(dá)的患者具有更長的生存優(yōu)勢。

胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)是5-FU代謝途徑的重要靶酶，其細(xì)胞內(nèi)的含量及其活性的變化可以影響5-FU的抗腫瘤活性。許多研究發(fā)現(xiàn)TS基因的低表達(dá)可以預(yù)測患者有較好的生存預(yù)后[6]。Pullarkat等[7]的研究發(fā)現(xiàn)TS高表達(dá)的患者預(yù)后差。一項有關(guān)5-氟尿嘧啶(5-FU)mRNA表達(dá)途徑基因個體化治療研究發(fā)現(xiàn)：TS低表達(dá)的晚期胃癌患者有可能從S-1的治療中獲益且具有更長的生存期[8]。本研究發(fā)現(xiàn)TS mRNA表達(dá)越低患者且具有更長的生存優(yōu)勢。

進(jìn)展期胃癌患者大多失去手術(shù)機(jī)會，腫瘤組織標(biāo)本獲取相對困難。本實驗利用患者外周血檢測DPD及TS mRNA表達(dá)，創(chuàng)傷小、具有可重復(fù)性、可行性高。本研究結(jié)果顯示：DPD及TS mRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者的預(yù)后有關(guān)。且DPD及TS mRNA同時低表達(dá)的患者，生存期更長。當(dāng)然，基于本研究的樣本量有限，還需進(jìn)行更多的檢測方法及更多的樣本量來發(fā)現(xiàn)更有價值的預(yù)后指標(biāo)。我們的研究結(jié)果提示，DPD mRNA及TS mRNA表達(dá)可單獨(dú)或聯(lián)合用于預(yù)測進(jìn)展期胃癌患者對含替吉奧方案的臨床預(yù)后。

[1]Langer R,Specht K,Becker K,et al.Comparison of pretherapeutic and posttherapeutic expression levels of chemotherapy-associated genes in adenocarcinomas of the esophagus treated by 5-Fluorou-racil and cisplatin-based neoadjuvant chemotherapy[J].Am Society for Clin Pathol,2007,128(2):191-197.

[2]van Groeningen CJ,Peters GJ,Schornagel JH,et al.PhaseI clinical and pharmacokinetic study of oral S-1 inpatients with advanced solid tumors[J].J Clin Oncol,2000,18(14):2772-2779.

[3]Voon PJ,Kong HL.Tumour genetics and genomics to personalise cancer treatment[J].Ann Acad Med Singapore,2011,40(8): 362-368.

[4]Toriumi F,Kubota T,Saikawa Y,et al.Thymidylate synthetase (TS)genotype and TS/dihydropyrimidine dehydrogenase mRNA level as an indicator in determining chemosensitivity to 5-fluorouracil in advanced gastric carcinoma[J].Anticancer Res,2004,24 (4):2455-2463.

[5]Matsubara J,Nishina T,Yamada Y,et al.Impacts of excision repair cross-complementing gene 1(ERCC1),dihydropyrimidine dehydrogenase,and epidermal growth factor receptor on the outcomes of patients with advanced gastric cancer[J].Br J Cancer,2008,98(4): 832-839.

[6]Theisen J,Danenberg K,Ott K,et al.Predictors of response and survival for neoadjuvant treated patients with esophageal adenocarcinoma[J].Dis Esophagus,2008,21(7):601-606.

[7]Pullarkat ST,Stoehlmacher J,Ghaderi V,et al.Thymidylate synthase gene polymorphism determines response and toxicity of 5-FU chemotherapy[J].Pharmacogenomics J,2001,1(1):65-70.

[8]Jeung HC,Rha SY,Shin SJ,et al.Predictive values of 5-fluorouracil pathway genes for S-1 treatment in patients with advanced gastric cancer[J].Anticancer Drugs,2011,22(8):801-810.

Relationship between the DPD and TSmRNA expressions and the prognosis to S-1-based chemotherapy in patients with advanced gastric cancer.

LIAN Lian1,SHEN Xiao-min1,ZHOU Chong2,LI Wei3,TAO Min3.
1. Department of Oncology,Xiangcheng People's Hospital,Suzhou 215131,Jiangsu,CHINA;2.Department of Radiation Oncology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221009,Jiangsu,CHINA;3.Department of Oncology,the First Hospital Affiliated to Soochow University,Suzhou 215006,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the relationship between the thymidine phosphorylase(DPD)and thymidylate synthase(TS)mRNA expressions and S-1-based chemotherapy prognosis in patients with advanced gastric can-cer(AGC).MethodsA total of 40 patients with pathologically confirmed AGC were enrolled in this study.Before the treatment,the expressions of DPD and TS mRNA in peripheral blood were determined using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Then the patients were administered with S-1-based regimen(S-1+cisplatin).The relationship between the DPD and TS mRNA expressions and prognosis in AGC patients were analyzed.ResultsThe median OS was 13.5 months in these 40 patients.It was 17 months in patients with low DPD mRNA expression and 10 months in those with high DPD mRNA expression(χ2=4.059,P=0.044).Also,it was 17 months in patients with low TS mRNA expression and 10 months in those with high TS mRNA expression(χ2=3.936,P=0.047).Pooled analysis showed that patients with both low DPD mRNA expression and low TS mRNA expression had even longer OS(χ2= 17.486,P=0.001).ConclusionThe detection of DPD and TS mRNA expression alone or in combination can be used to predict the prognosis inAGC patients.

DPD;TS;Advanced gastric cancer;S-1

R735.2

A

1003—6350（2015）06—0799—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0287

2014-08-21)

練 煉。E-mail：doraemonlian@sohu.com