蟛蜞菊烯酸鈉鹽抑制植物病原真菌菌絲生長活性研究

李守婷，周 艷，麻兵繼，阮 元，李 文

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南鄭州450002)

蟛蜞菊烯酸(grandiflorenic acid，GA)是一個貝 殼杉烷型二萜化合物，這類二萜化合物在香茶菜屬植物中分布廣泛［1-2］。研究表明，貝殼杉烷型二萜化合物具有多種藥理活性，如抗腫瘤［3］，抗感染［4］、抗氧化［5］和抗病毒等［6］。最新的文獻報道表明，貝殼杉烷型二萜化合物同樣具有顯著的抗植物病原真菌和細菌的作用［7-8］。20世紀70年代，南美葉蟛蜞菊(Werneria ciliolata)作為一種地被植物引入中國。該植物具有較強的繁殖特性，也有研究顯示其對其他植物有化感作用，因此往往形成單一的群落，并且不斷蔓延，逐漸成為中國主要的入侵物種之一［9］。為開發(fā)利用南美葉蟛蜞菊植物資源，作者對其進行了系統(tǒng)的化學成分研究，分離鑒定出一系列的貝殼杉烷型二萜化合物，其中蟛蜞菊烯酸的含量最豐富［10］。然而，蟛蜞菊烯酸的極性很小，常溫下不易溶于水。為提高蟛蜞菊烯酸水溶性，并探討該化合物在生物農(nóng)藥方面開發(fā)的可能性，本試驗首次利用化學方法合成了蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物(GA-Na)，進而利用PDA平板抑菌試驗方法篩選了該鈉鹽化合物對18種植物病原真菌菌絲生長抑制活性。另外，為了觀察蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物對病原真菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，本研究根據(jù)前期抑菌試驗結(jié)果，選取抑菌活性較強且菌絲生長周期短、生產(chǎn)上危害性大的小麥赤霉菌為代表真菌，利用顯微鏡觀察藥物處理后的菌絲形態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試藥物蟛蜞菊烯酸系河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院中藥化學實驗室自制，純度為95%以上。油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、煙草蛇眼菌(Alternaria pluriseptata)、玉米穗腐菌(Fusarium verticillioides)、茄子莖枯菌(Fusarium oxysporum f.sp.)、花生黑斑菌(Cercospora personata)、番茄早疫菌(Alternaria solani)、茄子綿疫菌(Phytophthora melongenae)、小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)、茶炭疽菌(Gloeosporium theae-sinensis)、玉米圓斑菌(Bipolaris carbonum)、蘋果炭疽菌(Glomerella cingulate)、煙草低頭黑菌(Colletotrichum capsici f.nicotianae)、葡萄柄孢菌(Cladosporium ladosporium sp.)、花生褐斑菌(Cercospora arachidicola)、柑橘炭疽菌(Colletotrichum gloeosprioides)、板栗炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides sp.)和牡丹炭疽菌(Gloeosporium sp.)等18種供試菌種均由河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院中藥化學實驗室提供并保存。

化合物氫譜和碳譜核磁共振數(shù)據(jù)由Bruker AM-400測定，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，耦合常數(shù)為Hz，化學位移值為×10-6。檢測用薄層層析材料GF254由青島海洋化工廠生產(chǎn)。

1.2 蟛蜞菊烯酸鈉鹽的制備

蟛蜞菊烯酸鈉鹽的制備參照文獻［8］的方法:在50 mL圓底燒瓶中加入300 mg蟛蜞菊烯酸(1 mmol)，再加入10 mL環(huán)己烷溶解。待蟛蜞菊烯酸完全溶解后，加入10 mL 0.5 mol·L-1NaOH 溶液，磁力攪拌，60℃水浴反應1 h。反應過程中用GF254薄層板每隔20 min檢測1次。待反應完全后，用布氏漏斗抽濾，除去溶劑。布氏漏斗中的剩余物反復用冷水清洗以除去雜質(zhì)，最后得到蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物(210 mg，0.65 mmol)。1H NMR(400 MHz，CDCl3):δ ppm 5.24(t，J=3.2 Hz，H-11)，4.91(s，H-17a)，4.80(s，H-17b)，1.22(s，H-18)，1.02(s，H-20);13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ ppm 40.6(C-1)，20.2(C-2)，38.5(C-3)，44.5(C-5)，18.8(C-6)，41.8(C-7)，43.1(C-8)，155.8(C-9)，39.2(C-10)，114.6(C-11)，37.8(C-12)，42.2(C-13)，44.3(C-14)，50.0(C-15)，158.8(C-16)，105.5(C-17)，28.7(C-18)，182.1(C-19)，23.2(C-20)。

1.3 蟛蜞菊烯酸鈉鹽抗菌譜測定

參照文獻［11］方法，精確稱取蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物和多菌靈，用少量無菌水溶解并定容至所需質(zhì)量濃度。用無菌PDA培養(yǎng)基分別制作質(zhì)量濃度為 0.50，0.25，0.125 g·L-1的 GA-Na 和多菌靈帶藥培養(yǎng)基，用等量滅菌的無菌水加入PDA中作空白對照，倒入無菌培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用無菌打孔器取直徑6 mm菌餅，接種于帶藥培養(yǎng)基平板中央，放入26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，取出培養(yǎng)皿并測量菌絲生長直徑/mm，按下式計算菌絲生長抑制率(I)。每個藥物質(zhì)量濃度重復3次，取平均抑制率。

1.4 小麥赤霉菌菌絲培養(yǎng)及顯微結(jié)構(gòu)觀察

小麥赤霉菌在空白PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d，待菌絲生長覆蓋整個平板后，用無菌打孔器取直徑9 mm的菌餅接到250 mL液體PDB培養(yǎng)基中。于28℃，180 r·min-1振蕩箱中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)小麥赤霉菌24 h后，設(shè)處理組和空白對照組。處理組加入一定量的蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物，使培養(yǎng)基藥液質(zhì)量濃度為0.50 g·L-1，空白對照組加滅菌的重蒸水。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別再將菌絲充分去除培養(yǎng)基后取微量菌絲在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟛蜞菊烯酸鈉鹽抗菌譜測定結(jié)果

蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物對18種植物病原真菌的菌絲生長抑制活性如表1所示。由表1可以看出，總體而言，蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物呈現(xiàn)出顯著的、廣譜的抗菌效果，并具有較好的量效關(guān)系。相同質(zhì)量濃度下，蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物對于部分病原真菌的抑菌效果比多菌靈還要強。在0.50 g·L-1質(zhì)量濃度下，蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物對油菜菌核菌、西瓜炭疽菌、煙草蛇眼菌、玉米穗腐菌、茄子莖枯菌、花生黑斑菌和番茄早疫菌的抑制效果超過60%，其中，油菜菌核菌和西瓜炭疽菌對藥物敏感，抑制率高達98.0%和80.6%，抑菌效果接近相同質(zhì)量濃度的多菌靈;對10種病原真菌茄子綿疫菌、小麥赤霉菌、茶炭疽菌、玉米圓斑菌、蘋果炭疽菌、煙草低頭黑菌、葡萄柄孢菌、花生褐斑菌、柑橘炭疽菌和板栗炭疽菌顯示出中等抑菌作用，抑菌率超過40%。蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物在0.50 g·L-1質(zhì)量濃度條件下僅對牡丹炭疽菌的抑制效果較弱，但抑菌率也達到了35.9%。

表1 蟛蜞菊烯酸鈉鹽和多菌靈對18種病原真菌的抑菌率Table 1 The inhibitory effect of GA-Na and carbendazim on 18 pathogenic fungi %

蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物在0.25 g·L-1質(zhì)量濃度下對油菜菌核菌、煙草蛇眼菌和玉米穗腐菌顯示很好的抑菌效果，抑制率超過60%，對另外11種病原真菌顯示中等強度的抑菌效果(抑制率超過40%)。隨著蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物藥物質(zhì)量濃度的下降，其抑菌效果也逐漸下降。在0.125 g·L-1質(zhì)量濃度下，蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物僅對油菜菌核菌顯示顯著的抑菌作用，對煙草蛇眼菌等10種病原真菌顯示中等強度的抑菌效果。另外，在0.125 g·L-1質(zhì)量濃度下，陽性對照藥多菌靈雖然對油菜菌核菌、西瓜炭疽菌、玉米穗腐菌、茶炭疽菌、蘋果炭疽菌、煙草低頭黑菌和板栗炭疽菌7種病原真菌有很好的抑制效果，但對其他11種病原真菌幾乎沒有明顯的抑制效果。

圖1 蟛蜞菊烯酸鈉鹽對小麥赤霉菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of GA-Na on the morphology structure of F.graminearum

2.2 蟛蜞菊烯酸鈉鹽對小麥赤霉菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

分別將少量小麥赤霉菌空白組菌絲和蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物處理組菌絲放在顯微鏡下進行觀察，結(jié)果如圖1所示。通過顯微觀察，發(fā)現(xiàn)空白組菌絲生長稠密，藥物處理組菌絲體生長稀疏，菌絲體數(shù)量減少，分支較少;通過高倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空白組菌絲體粗大飽滿，分支明顯，藥物處理組菌絲纖細，分支較弱。說明蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物對小麥赤霉菌菌絲的生長發(fā)育具有明顯的抑制作用。

3 討論

由于蟛蜞菊烯酸化學結(jié)構(gòu)中極性取代基少，導致水溶性很差，常溫下在水中幾乎不溶解。本試驗通過制備蟛蜞菊烯酸的鈉鹽化合物，改善了其水溶性。參考文獻［12］的方法，測定了蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物在25℃下水中的溶解度大約為6 g·L-1。在含藥PDA平板制作過程中基本沒有藥物的析出，保證了抑菌試驗結(jié)果的可靠性。蟛蜞菊烯酸的鈉鹽化合物在0.50和0.25 g·L-1質(zhì)量濃度下對多種常見植物病原真菌菌絲生長抑制效果顯著，部分病原真菌如煙草蛇眼菌、茄子頸枯菌、花生黑斑菌、番茄早疫菌、茄子綿疫菌等的抑菌效果超過相同質(zhì)量濃度的陽性對照藥多菌靈，表明該化合物具有廣譜的抗病原真菌作用。但隨著蟛蜞菊烯酸的鈉鹽化合物質(zhì)量濃度的下降，其抗菌效果也下降，0.25 g·L-1質(zhì)量濃度下僅對油菜菌核菌抑制率超過60%。另外，顯微觀察試驗選取小麥赤霉菌為代表真菌是因為該病原真菌生長周期短，在固體PDA平板上一般4～5 d即可長滿平板，接種到液體PDB培養(yǎng)液中一般生長3～4 d即可達到最大生物量。為了觀察到明顯的藥物抑菌效果，在液體PDB培養(yǎng)液中加入了較高質(zhì)量濃度的蟛蜞菊烯酸的鈉鹽化合物，即0.50 g·L-1。顯微觀察結(jié)果表明，蟛蜞菊烯酸的鈉鹽化合物對小麥赤霉菌的菌絲生長具有明顯的抑制作用，菌絲的分化也受到明顯抑制。然而，該化合物對病原真菌的具體抗菌作用靶點及作用機制仍需進一步明確，大田藥效仍需進一步試驗驗證。

近年來隨著化學合成農(nóng)藥在生態(tài)環(huán)境中造成的危害日趨嚴重，環(huán)境友好型的生物農(nóng)藥的研發(fā)日益受到人們的重視。當前部分植物源生物農(nóng)藥已成功開發(fā)上市，如苦參堿制劑、除蟲菊酯制劑、魚藤酮制劑等［13］。本試驗所用的蟛蜞菊烯酸直接從南美蟛蜞菊中提取，在植物體內(nèi)含量較豐富，具有一定的深入開發(fā)價值。本試驗通過制備蟛蜞菊烯酸鈉鹽化合物改善水溶性，進而研究其抗病原真菌活性，將為下一步充分利用南美蟛蜞菊及其代謝產(chǎn)物蟛蜞菊烯酸在生物農(nóng)藥方面的開發(fā)應用奠定基礎(chǔ)。

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