反硝化細(xì)菌固定化降解亞硝酸鹽的研究

曹月坤，林曉東，李長(zhǎng)波，姚秀清

亞硝酸鹽作為生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的一個(gè)自然組成部分，廣泛存在于天然水體中。水體中亞硝酸鹽是一種潛在危險(xiǎn)物，含量過(guò)高會(huì)對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用，是比較棘手的問(wèn)題［1-2］。反硝化細(xì)菌是一類能利用亞硝酸鹽氮等為氮源，有機(jī)質(zhì)為碳源，且能進(jìn)行自身繁殖的微生物。在反硝化過(guò)程中，能將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氮?dú)鈴亩_(dá)到降低水體中有害物質(zhì)的積累。但直接應(yīng)用反硝化細(xì)菌降解養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽會(huì)產(chǎn)生菌濃低、易流失、不容易控制等問(wèn)題。固定化微生物技術(shù)強(qiáng)化生物脫氮過(guò)程是近年來(lái)研究的焦點(diǎn)。李芳芳等［3］研究了固定化硝化菌和好氧反硝化菌對(duì)氨氮廢水的處理，氨氮去除率達(dá)到90.31%，亞硝酸鹽積累僅0.032 mg/L。Lu Yu 等篩選了兩株細(xì)菌，分別為Stenotrophomonas sp. ZZ15 和Oceanimonas sp. YC13，添加到工業(yè)廢水處理裝置中可以增加硝酸鹽的去除率，固定化的ZZ15 和YC13與直接添加相比，去除率的增加幅度相對(duì)較低［4］。Christopher B Hill 等對(duì)比了硝化菌，以及硝化菌與反硝化菌的混合菌群固定化用于脫除廢水中氨氮的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種固定化細(xì)菌體系對(duì)氨氮的去除效果相當(dāng)，不同之處在于固定化的硝化-反硝化菌體系沒(méi)有硝酸鹽積累［5］。鄭黎明對(duì)國(guó)內(nèi)外包埋法固定化技術(shù)生物脫氮的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，認(rèn)為微生物固定化可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物脫氮方法中的不足，達(dá)到高效脫氮的目的［6］。但大部分相關(guān)研究工作都針對(duì)生活或工業(yè)廢水，對(duì)較低亞硝酸鹽含量的養(yǎng)殖水體利用固定化反硝化菌處理的研究較少。本文以實(shí)驗(yàn)室富集培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了包埋固定化，為固定化反硝化細(xì)菌降解亞硝酸鹽的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉、聚乙烯醇、氯化鈉、氯化鈣、硝酸鈉、亞硝酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸、甲醇、氫氧化鈉、無(wú)水氯化鈣、硫酸銅、無(wú)水乙醇、硫酸鋅、硫酸肼、葡萄糖、鹽酸、檸檬酸、蔗糖均為分析純;磺胺、N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽均為化學(xué)純。

W-O 系列恒溫油水浴鍋;VIS-7220 可見(jiàn)分光光度計(jì);LD5-2A 低速離心機(jī);BT125D 電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng) 富集培養(yǎng)基:葡萄糖5 g，硝酸鈉1 g，氯化鈣0. 67 g，磷酸氫二鉀6.7 g，10 L 水。

1.2.2 反硝化細(xì)菌菌懸液的制備 將本實(shí)驗(yàn)富集培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液在4 000 r/min 條件下離心10 min，倒掉上清液，沉淀用自來(lái)水稀釋，制成菌懸液。

1.2.3 固定化反硝化細(xì)菌小球的制備 SA 制備的小球:①將SA 用水浸泡24 h，然后加熱溶解，冷卻至35 ℃;②取適量菌懸液，按照菌懸液與SA 溶液體積比1 ∶2 的比例混合，充分?jǐn)噭?③配制5%CaCl2溶液，用注射器將②配制的混合液緩慢滴入，不斷攪拌在液體中形成小球;④小球在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)4 h;⑤濾出小球，用生理鹽水洗滌2 ～3次，備用。

PVA 制備的小球:①將浸泡24 h 的PVA 加熱溶解，冷卻至35 ℃;②取適量菌懸液，按菌懸液與PVA 溶液體積比1∶2 的比例混合，充分?jǐn)噭?③將配制的PVA-菌體混合液緩慢滴入到1% CaCl2溶液中;④小球在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)10 h;⑤濾出小球，用生理鹽水洗滌2 ～3 次，備用。

PVA+ SA 制備的小球:①將PVA 和SA 浸泡24 h，加熱溶解，冷卻至35 ℃;②取適量菌懸液，按菌懸液與PVA+SA 混合液(SA 和PVA 體積比1∶1)體積比1∶2 的比例混合，充分?jǐn)噭?③將配制的PVA+SA-菌體混合液緩慢滴入到1% CaCl2溶液中;④小球在CaCl2溶液中繼續(xù)交聯(lián)10 h;⑤濾出小球，用生理鹽水洗滌2 ～3 次，備用。

1.2.4 不同包埋方法對(duì)亞硝酸氮去除的影響 配制NO2

－-N 濃度50 mg/L 和葡萄糖濃度140 mg/L的模擬養(yǎng)殖水體。按照1.2.3 節(jié)分別制備3 種小球各10 mL，然后分別加入到50 mL 的模擬養(yǎng)殖水體中，在28 ℃條件下處理，每24 h 測(cè)定-N 濃度。

1.3 分析方法

2 結(jié)果與討論

2.1 3 種不同固定化方法制備的反硝化細(xì)菌小球性質(zhì)比較

分別以SA、PVA、PVA +SA 的混合物為包埋材料對(duì)反硝化細(xì)菌進(jìn)行固定化，制備的3 種小球分別見(jiàn)圖1 ～圖3。

圖1 SA 固定的反硝化細(xì)菌小球Fig.1 The balls of denitriobacteria immobilized by SA

圖2 PVA 固定的反硝化細(xì)菌小球Fig.2 The balls of denitriobacteria immobilized by PVA

圖3 SA+PVA 固定的反硝化細(xì)菌小球Fig.3 The balls of denitriobacteria immobilized by PVA and SA

由圖1 ～圖3 可知，以SA 固定的反硝化細(xì)菌小球，制備時(shí)易成球，不易粘連較透明，交聯(lián)后的小球強(qiáng)度好，抗擠壓，彈性好。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)小球有明顯的消溶現(xiàn)象。48 h 后小球體積減少1/2，預(yù)計(jì)4 ～5 d 小球會(huì)完全破碎溶解。以PVA 固定的反硝化細(xì)菌小球，未滴前透明度最好，小球不易成型也不易變色，易粘連，不易分開(kāi)，形成串珠狀，交聯(lián)后的小球強(qiáng)度低，擠壓后變形且不可恢復(fù)，粘度大，彈性差。以PVA+SA 混合物固定的反硝化細(xì)菌小球，小球大小均勻，形狀飽滿且不易粘連。交聯(lián)后，在強(qiáng)度、抗擠壓能力、彈性、大小方面與SA 小球相似。小球的顏色則介于SA 的半透明和PVA 的白色之間。試驗(yàn)過(guò)程中，并沒(méi)有像SA 小球那樣明顯的消融現(xiàn)象，反應(yīng)過(guò)程現(xiàn)象更接近于PVA 小球。

2.2 3 種不同固定化方法對(duì)反硝化細(xì)菌降解亞硝酸鹽的影響

將分別以SA、PVA 和PVA +SA(v/v =1∶1)包埋制備的反硝化細(xì)菌制成的小球置于模擬養(yǎng)殖水體中，分別測(cè)定培養(yǎng)24，48 h 的NO2－-N 去除率，并觀察小球變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖4 。

圖4 3 種不同方法固定化小球?qū)?N 脫除率的影響Fig.4 The effect of balls immobilized by different materials on removal rate of nitrite

由圖4 可知，3 種不同材料固定的反硝化細(xì)菌小球?qū)O2－-N 的去除率在24 h 均達(dá)到80%以上，去除率由高到低依次為:PVA、PVA + SA 和SA 小球，分別為85%，84%和82%。48 h 后3 種小球的去除率較24 h 都有所提高，但去除率最高的仍為PVA 小球，達(dá)到88%，其次PVA + SA 小球，達(dá)到87%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，SA 小球雖然有消融現(xiàn)象，但彈性和機(jī)械強(qiáng)度較好;而PVA 小球的彈性和機(jī)械強(qiáng)度較差，有比較嚴(yán)重的吸附粘連和膨脹現(xiàn)象，容易結(jié)成團(tuán)狀，減小接觸面積，從而影響NO2－-N 的去除率;PVA+SA 混合小球的彈性、通透性和機(jī)械強(qiáng)度介于兩者之間，可減少小球的消融和粘連現(xiàn)象，增加小球的機(jī)械強(qiáng)度。

2.3 溫度對(duì)PVA +SA 反硝化細(xì)菌小球降解亞硝酸鹽氮效果的影響

以PVA+SA 混合包埋小球?yàn)檠芯繉?duì)象，研究了不同溫度下不同時(shí)間反硝化細(xì)菌對(duì)NO2－-N 去除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)PVA+SA 混合包埋小球-N 去除率的影響Fig.5 The effect of temperature on removal rate of nitrite of balls immobilized by PVA and SA

由圖5 可知，24 h 時(shí)在20 ～32 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，亞硝酸鹽氮去除率呈增加的趨勢(shì)，32 ℃去除率達(dá)到82%，而20 ℃去除率僅為45%。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，20，25，28 ℃三個(gè)溫度的去除率都有所增加，但32 ℃時(shí)，48 h 和72 h 的去除率反而有所下降，反而低于相同時(shí)間28 ℃的去除率。原因可能為在24 h 時(shí)，適當(dāng)提高溫度有利于反硝化細(xì)菌-N 的去除，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高溫反而使反硝化細(xì)菌酶活性有所降低，因此采用28 ℃作為較合適的溫度。

2.4 PVA 和SA 不同比例對(duì)NO2－-N 去除效果的影響

選取PVA 與SA 比例為1∶1，5∶1 和10∶1 分別包埋制成小球，命名為小球a、小球b 和小球c。考察了PVA 和SA 比例對(duì)NO2－-N 去除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同比例包埋小球?qū)?N 去除率的影響Fig.6 The effect of different proportion on removal rate of nitrite of balls immobilized by PVA and SA

由圖6 可知，3 種小球在24 h 時(shí)的亞硝酸鹽氮去除率基本相同，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種小球的去除率都有所增加，但增加幅度不大，尤其是小球a。在48 h 和72 h 時(shí)，小球c 的去除率高于小球b，但相差不大。PVA 和SA 的不同比例影響了細(xì)胞的成活率、小球和溶液的接觸面積等，最終影響細(xì)胞的生物活性和反應(yīng)速率。因?yàn)?∶1 和1∶5 比例的混合小球都存在輕微的消融現(xiàn)象，小球c 的比例1∶10 更適用于實(shí)際應(yīng)用。

2.5 碳源對(duì)亞硝酸鹽氮去除效果的影響

以混合小球c 為考察對(duì)象，分別以檸檬酸、蔗糖、乙醇、葡萄糖、甲醇作為碳源，碳源濃度均為280 mg/L，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 碳源對(duì)小球-N 去除率的影響Fig.7 The effect of different carbon sources on removal rate of nitrite

由圖7 可知，小球c 利用這5 種不同碳源進(jìn)行反硝化作用時(shí)，去除率有很大的不同。24 h 時(shí)，利用蔗糖和乙醇作為唯一碳源時(shí)，亞硝酸鹽氮去除效果最好，為35%和37%。當(dāng)以葡萄糖和檸檬酸作為唯一碳源時(shí)，反硝化效果較蔗糖和乙醇低，去除率為29%和30%，最低的是甲醇為21%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，除了檸檬酸外，其它4 種碳源的去除率都有了較大程度的提高。以葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，雖然在前期反硝化效果不及蔗糖，但后期去除效果有明顯增加，96 h 時(shí)，去除率由高到低依次為葡萄糖81%、乙醇71%、甲醇63%、蔗糖55.6%、檸檬酸38.6%。因此，可以考慮以葡萄糖作為較合適的碳源。

2.6 碳氮比對(duì)亞硝酸鹽氮去除效果的影響

對(duì)混合小球c 進(jìn)行碳氮比考察，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8 可知，在4 種不同的碳氮比條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NO2－-N 的去除率都隨之增大，并且除去碳氮比為25∶1 時(shí)，其它3 種比例都在48 h 時(shí)去除率達(dá)到較大值，之后增幅不大。同時(shí)，隨著碳氮比的減小，去除率相應(yīng)增加。可能的原因是，碳氮比越大，碳源相對(duì)越豐富，這使包埋的反硝化細(xì)菌有足夠的能源先滿足自身的生長(zhǎng)代謝而延緩了反硝化作用的速率，同時(shí)足夠的碳源也使小球維持較穩(wěn)定的去除速率。但在實(shí)際應(yīng)用中，碳源過(guò)多不但會(huì)使成本升高，也會(huì)延緩去除率的增加，延長(zhǎng)達(dá)到理想去除效果的時(shí)間。鑒于圖8 的結(jié)果，選用2.5∶1 為較適宜的碳氮比。

圖8 不同C/N 比對(duì)包埋小球去除率的影響Fig.8 The effect of different C/N on removal rate of nitrite of balls

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所考察的3 種反硝化細(xì)菌固定化方法中，以海藻酸鈉和聚乙烯醇為混合材料制備的小球彌補(bǔ)了單一材料的不足，兼具兩種方法的優(yōu)勢(shì)。該種方法最適條件為:溫度28 ℃，聚乙烯醇和海藻酸鈉的比例為10∶1，葡萄糖為碳源，碳氮比2.5∶1，亞硝酸鹽氮的最大去除率72 h 能達(dá)到92%。

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