高效液相色譜搭載可變波長檢測器測定桃果肉中糖組分

嚴 娟， 蔡志翔， 馬瑞娟， 張斌斌， 沈志軍， 郭紹雷， 俞明亮

( 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京210014)

果品中含多種糖分，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多為異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)差異性小，采用常規(guī)方法對其分離鑒定比較困難。加之單糖既無強的紫外吸收，又無熒光基團，而且在通常情況下為電中性，植物組織中糖檢測廣泛應(yīng)用的高效液相色譜法( HPLC) 通常需要進行衍生反應(yīng)，使之具有強紫外吸收、熒光特性或其他一些可測定的物理化學(xué)性質(zhì)，再使用選擇性檢測器如紫外檢測器、熒光檢測器等進行檢測［1-5］，但這樣處理步驟復(fù)雜，可能會導(dǎo)致不穩(wěn)定基團的分解，造成測定結(jié)果的偏差［6］。目前常采用液相色譜搭載通用型檢測器，如示差折光檢測器( HPLC-RID) 測定蔬菜果品中糖組分［7-10］，樣品不需衍生化處理，可以直接測得糖分，但相對于紫外檢測器而言，示差折光檢測器( RID) 靈敏度不高，且易受外界環(huán)境干擾，對溫度變化非常敏感，難以平衡，流動相的波動、洗脫液比的變化等都會明顯影響折射率。

可變波長檢測器( VWD) 是紫外檢測器的一種，幾乎所有的HPLC 都配有這種檢測器。VWD 選擇性高，對溫度、流動相的波動和組成的變化不甚敏感。液相色譜搭載可變波長檢測器( HPLC-VWD)具有良好的光學(xué)性能，廣泛用于對大多數(shù)有紫外吸收的化合物的檢測［11-14］。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍認為HPLC-VWD 不適用于糖類物質(zhì)的檢測，這是因為糖類特別是葡萄糖等物質(zhì)吸光度極其微弱，需要選用很低的波長區(qū)間進行檢測，而常用測定糖類的色譜條件選擇的流動相的截止波長都較高，會產(chǎn)生背景吸收。有文獻總結(jié)稱選擇性檢測器無法對糖類組分進行檢測［15-16］，而VWD 就是典型的選擇性檢測器。也就是說，一直存在VWD 不適用于檢測糖類物質(zhì)的技術(shù)偏見。謝志剛等［17］利用HPLCVWD 直接測定硫酸氨基葡萄糖氯化鉀膠囊中氨基葡萄糖的含量。氨基葡萄糖是一種天然的氨基單糖，是葡萄糖中的一個羥基被氨基取代，多了一個氮元素，是直鏈伯胺，具有胺的性質(zhì)［18］，因此謝志剛等［17］報道的采用氨基柱，無需衍生化直接對氨基葡萄糖進行測定的HPLC-VWD 法，對植物組織中廣泛存在的，由碳、氫、氧三元素構(gòu)成的糖類物質(zhì)，如蔗糖、葡萄糖、果糖等的檢測不具有通用性?？傊?，目前為止，尚無HPLC-VWD 用于直接檢測果品以及其他植物組織中各種糖類的記載。本試驗擬建立一種無需衍生即可直接測定果品中糖組分的HPLCVWD 法，為測定果品和其他植物組織中糖組分含量提供一種簡單有效的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗果品包括紫金紅1 號桃和5 個果肉中糖類含量高低較典型的桃品種( 參照沈志軍等［19］的結(jié)果，5 個桃品種分別為低蔗糖低果糖的烏雞黑肉桃、高蔗糖的日本86、低葡萄糖的霞暉5 號，高葡萄糖高果糖高山梨醇的黑油桃、低山梨醇的金山早紅) ，均取自國家果樹種質(zhì)南京桃資源圃，按照常規(guī)栽培方法種植，統(tǒng)一田間管理。另參照文獻［10］、［20］、［21］、［22］選擇其他4 種水果作為驗證，包括含微量蔗糖、高葡萄糖高果糖、無山梨醇的葡萄巨玫瑰、以積累果糖為主的蘋果紅富士、以積累蔗糖為主的粉蕉廣粉1 號和高山梨醇的梨豐水作為試驗材料進行糖組分測定。果實洗凈后用吸水紙吸干，迅速刨皮，果肉用液氮速凍后置于－20 ℃冰箱備用。

1.2 試劑與設(shè)備

本試驗選擇果品中常見的蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇共4 種糖類為標(biāo)準(zhǔn)品，均購自Sigma 公司;乙醇試劑為分析純。

Agilent 高效液相色譜系統(tǒng): 1100 系列，CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm× 300.0 mm，10 μm) 柱，VWD 和RID 2 種檢測器。真空濃縮儀。

1.3 HPLC-VWD 法測定水果中糖組分

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品1.6 g，用超純水溶解定容，制得濃度為160 g/L的各標(biāo)準(zhǔn)品母液;并用超純水逐級減倍稀釋，制得各級別單標(biāo)溶液和混標(biāo)溶液備用。

1.3.2 色譜條件 由于考慮到糖的吸光度很微弱，用VWD 檢測需要選很低的波長區(qū)間，而所用溶劑和流動相的截止波長也必須要低。本試驗采用色譜柱CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm× 300.0 mm，10 μm) ，流動相為超純水，其截止波長只有190 nm，樣品溶劑也相應(yīng)用超純水，完全符合VWD 檢測糖時要求波長低的首要條件; 同時對波長190 nm、195 nm、和200 nm 進行洗脫篩選; 流速和柱溫均按照適于該色譜柱的最佳條件，即流速0.5 ml/min，柱溫80 ℃;考慮到色譜柱的承載能力和檢測器的靈敏度，對進樣量大小作了5 μl、10 μl 和15μl 的篩選。在對VWD 和RID 2 種檢測器檢測結(jié)果進行比較時，色譜條件保持一致。

1.3.3 樣品的制備 稱取果品果肉勻漿1.0 g，加入7 ml 80%乙醇( 體積比) ，室溫提取48 h，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10.0 ml;吸取2.0 ml 提取液濃縮至干，再用0.5 ml 超純水溶解，經(jīng)0.22 μm 水系濾頭過濾后進色譜柱。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及方法評價 在確定的色譜條件下，分別將不同濃度的糖混標(biāo)溶液進樣分析，所用混標(biāo)濃度梯度為40.000 g/L、20.000 g/L、10.000 g/L、5.000 g/L、2.500 g/L、1.250 g/L、0.625 g/L，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量關(guān)系進行線性回歸。

對方法的線性范圍、最低檢出限、回收率和精密度進行測定［14］。移取各糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 ml 分別加入0.5 g 紫金紅1 號桃果肉勻漿樣品中，按照上述方法進行提取和HPLC-VWD 測定，重復(fù)6 次，根據(jù)結(jié)果計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。取各級別濃度的糖單標(biāo)溶液，進樣測定，得到最低檢出限( 以信噪比S/N=3 時的質(zhì)量濃度為最低檢出限) 。

1.4 HPLC-VWD 和HPLC-RID 法測定5 個桃品種糖含量

將制備好的桃樣品按確立的色譜條件分別用HPLC-VWD 和HPLC-RID 進行測定，利用SPSS 軟件配對樣本t 檢驗，比較2 種檢測器測定的糖含量的差異。

1.5 HPLC-VWD 法測定其他水果中糖含量

將制備好的果品樣品按確立的HPLC-VWD 檢測條件進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-VWD 測定方法的建立

使用HPLC-VWD 方法測定糖，最關(guān)鍵的是波長的選擇。本試驗對190 nm、195 nm、200 nm 3 個波長進行洗脫篩選，發(fā)現(xiàn)190 nm 分離糖組分的效果最好。同時進樣量的大小對分離效果并沒有太大影響，考慮到色譜柱的承載能力，將進樣量定為5 μl。因此確定了HPLC-VWD 檢測水果中糖組分的色譜條件為: 流動相超純水，進樣量5 μl，流速0.5 ml/min，溫度80 ℃，檢測波長190 nm。在此條件下各糖類物質(zhì)分離效果好，色譜峰正常穩(wěn)定，得到了4種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖( 圖1) 和紫金紅1 號桃樣品圖( 圖2) ，30 min 即可完成樣品的檢測。

圖1 4 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC-VWD 圖Fig.1 Chromatogram of four kinds of sugars in a standard mixture by HPLC-VWD

圖2 紫金紅1 號桃果肉樣品中糖的HPLC-VWD 圖Fig.2 Chromatogram of sugars extracted from Zijinhong 1 peach flesh by HPLC-VWD

2.2 HPLC-VWD 檢測方法的評價

線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、最低檢出限和回收率見表1。在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，各種糖線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達0.999 9以上，相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.53% ～2.71%，回收率為92% ～103%，精密度較高，結(jié)果準(zhǔn)確。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和方法評價結(jié)果Table 1 Linear equation between peak area and sugar content detected by HPLC-VWD and evaluation of the method

2.3 HPLC-VWD 和HPLC-RID 法測定5 個桃品種中糖含量結(jié)果的比較

5 個桃品種樣品分別用HPLC-VWD 和HPLCRID 法測定的糖組分含量結(jié)果見表2。2 種方法對各種糖含量高低典型的桃品種的4 種糖測定結(jié)果都能反應(yīng)出各品種糖含量的特點，即烏雞黑肉桃明顯表現(xiàn)為低蔗糖低果糖，日本86 為高蔗糖，霞暉5 號為低葡萄糖，黑油桃為高葡萄糖高果糖高山梨醇，金山早紅為低山梨醇。5 個品種每種糖的HPLC-VWD 和HPLC-RID 法所測得結(jié)果差異不顯著( P ＞0.05) 。

表2 HPLC-VWD 和HPLC-RID 法測定的不同桃品種糖組分含量Table 2 Sugars contents in different peach cultivars detected by HPLC-VWD and HPLC-RID

2.4 HPLC-VWD 法測定其他果品中糖含量

葡萄品種巨玫瑰、蘋果品種紅富士、粉蕉品種廣粉1 號和梨品種豐水4 種果品樣品HPLC-VWD 檢測色譜圖見圖3，各糖組分含量見表3。各果品中糖種類和含量水平與其他文獻報道的結(jié)果一致，表現(xiàn)為在葡萄中未檢出山梨醇，蘋果中果糖含量最高，香蕉中蔗糖含量最高，梨中含有豐富的山梨醇［10，20-22］。

圖3 4 種水果果肉樣品中糖含量的HPLC-VWD 圖Fig.3 Chromatogram of sugar contents in the flesh of four fruits by HPLC-VWD

表3 4 種水果果肉樣品中糖含量Table 3 Sugar contents in the flesh of four fruits

3 討論

糖類是水果中重要的品質(zhì)指標(biāo)，對其檢測方法需要沿著高靈敏度、快速測定及高選擇性的方向發(fā)展。由于可用于糖類物質(zhì)直接檢測的RID 本身存在不穩(wěn)定和靈敏度低的問題，而且間接測定的衍生化方法程序繁雜、反應(yīng)條件較苛刻、反應(yīng)速度較慢［6］，因此在尋找反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快的衍生化方法的同時［18］，建立一種高效液相色譜搭載靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性高的紫外檢測器直接檢測糖組分的方法將具有較大的研究意義。

因為糖類吸光度弱，需要很低的檢測波長區(qū)間，要實現(xiàn)HPLC-VWD 直接檢測糖類物質(zhì)，最重要的問題是解決流動相的截止波長的問題，才能防止出現(xiàn)背景吸收。衍生化間接測定的HPLC 法大多采用C18和氨基色譜柱等，流動相多為鹽類緩沖液，檢測波長較高，造成實踐中一直無法利用VWD 對糖類進行直接檢測［3-5］。本研究選擇的CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm×300.0 mm，10 μm) 柱［23］，流動相為超純水，其截止波長為190 nm，通過試驗篩選，在該檢測波長下，果品中各糖類物質(zhì)能很穩(wěn)定地分離，在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53% ～2.71%，回收率為92% ～103%;另外，為了避免葡萄糖等組分出現(xiàn)假波峰，定量缺乏可靠性的現(xiàn)象出現(xiàn)，特設(shè)計了不同桃品種糖組分HPLC-VWD 和HPLC-RID 2 種檢測方法的比較試驗，結(jié)果顯示兩種方法的檢測結(jié)果沒有顯著差異，說明HPLC-VWD 可以真實穩(wěn)定地對糖類進行分離和檢測。

另外需要指出的是:①由于VWD 檢測器和RID檢測器的靈敏度在實際應(yīng)用中基本接近，在本研究中未列出2 種方法的檢出限比較數(shù)據(jù); ②針對目前一些實驗室常搭載DAD( 二極管陣列) 檢測器進行液相測定，因此可考慮HPLC-DAD 是否也可適用于對果品糖組分的測定;③本研究所得HPLC-VWD 方法可以對果品果肉中糖組分進行分離檢測，那么是否適用于其他植物組織，如花、葉、枝等糖組分的檢測還有待研究，因為本方法的檢測波長為190 nm，可能會受一些組織中含量較高的、在該波段有紫外吸收的物質(zhì)( 如酚類等) 的影響，無法準(zhǔn)確定性定量，因此在實際應(yīng)用中，可考慮在上柱分析前結(jié)合大孔樹脂等材料分離除去相應(yīng)的干擾物質(zhì)。

本研究利用HPLC-VWD 法，采用CARBOSep CHO-620 ( Ca 型，6.5 mm×300.0 mm，10 μm) 柱，以超純水為流動相沖洗，流速0.5 ml/min，溫度80℃，檢測波長190 nm，適于果品中糖組分的直接測定。該法無需衍生反應(yīng)，操作簡單，精確可靠，打破了一直存在的HPLC-VWD 無法直接測定糖類物質(zhì)的技術(shù)偏見，可為利用HPLC 測定水果和其他植物組織中糖組分含量提供一種新的檢測方法。

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