銅脅迫對海菜花幼苗生理特征的影響

朱 健， 張志紅， 范菲菲， 趙麗華

(1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽550025; 2.貴州省土壤肥料研究所，貴州 貴陽550006)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用的大量高銅殺菌劑、工業(yè)廢水、礦山排水等多種原因?qū)е滤w中銅污染日益加劇。銅作為植物生長所必需的一種微量元素，人們對其營養(yǎng)功能已有較為完整的認(rèn)識。但植物正常生長所需要的銅量很少，當(dāng)過量銅被植物吸收后，會對植物產(chǎn)生毒害作用，抑制植物的生長發(fā)育甚至死亡［1-2］。

海菜花屬于水鱉科，是中國特有三級重點保護(hù)高原淡水植物，其生長對水質(zhì)要求很高，對水生生態(tài)系統(tǒng)具有重要的生態(tài)作用［3］。受水質(zhì)惡化的影響，中國海菜花的分布急劇減少，而重金屬對海菜花生理的影響還鮮見報道。因此，本研究模擬重金屬銅對海菜花生長的生理影響，探討銅對海菜花的毒性機(jī)制，以期為保護(hù)和恢復(fù)海菜花提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試海菜花幼苗采自貴州省貴陽市花溪區(qū)花溪河平橋段。各分析純、生化純試劑都用超純水配制。

1.2 試驗設(shè)計

將采集的海菜花幼苗用自來水、超純水洗凈，1/10濃度Hoagland 營養(yǎng)液馴養(yǎng)7 d。在1/10 濃度Hoagland 培養(yǎng)液中加入CuSO4，使添加外源Cu2+濃度分別為: 0、0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L。選取長勢一致的海菜花幼苗分別植入Cu2+溶液中進(jìn)行脅迫處理。試驗于溫度20 ℃，相對濕度80%，光照14 h/d 的恒溫溫室中進(jìn)行。每天添加適量的超純水補(bǔ)償損失水分，培養(yǎng)7 d 后測定相同葉齡葉片中葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性蛋白質(zhì)以及葉片中Cu2+含量以及超氧化物歧化酶( SOD) 、過氧化物酶( POD) 和過氧化氫酶( CAT) 活性。3 次重復(fù)。

1.3 分析方法

1.3.1 葉綠素、類胡蘿卜素含量測定 取處理幼苗相同葉齡相同部位葉0.5 g，以80%丙酮提取，用分光光度計測定663 nm、645 nm、470 nm 吸光度［4］。

1.3.2 SOD、POD、CAT 活性和可溶性蛋白質(zhì)含量測定 取處理植株相同葉齡葉片，加入少量0.1 mol/L( pH=7.8) 的磷酸緩沖液，置冰浴研磨勻漿，離心(12 000 r/min，4 ℃，15 min) ，上清液用于酶活性與可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。SOD 活性測定采用NBT 光化還原法［4］，POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法［4］，CAT 活性測定采用南京建成科技有限公司CAT 試劑盒測定。可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法［5］。

1.3.3 銅含量測定 將處理后的葉片自然風(fēng)干，研磨，取0.05 g 樣品加4 ml 硝酸、1 ml 高氯酸消解，1%硝酸定容至25 ml，電感耦合等離子體質(zhì)譜測定Cu2+含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，變化趨勢圖用origin7.0 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對海菜花幼苗葉片光合色素含量的影響

植物葉片光合色素含量與光合作用強(qiáng)度等因素密切相關(guān)，因此常用光合色素含量的高低來表征植物在逆境條件下受傷害的程度。由表1 可知，海菜花幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素隨著Cu2+處理濃度的增加而逐漸降低，且均與對照差異顯著( P ＜0.05) 。當(dāng)溶液中Cu2+處理濃度達(dá)到0.4 mg/L時，海菜花幼苗的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素分別比對照降低了36.7%、40.8%、37.9%、38.8%，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。說明，高濃度的Cu2+降低了海菜花幼苗葉片中光合色素含量，減弱其光合作用強(qiáng)度，抑制海菜花幼苗的生長。

表1 Cu2+脅迫對海菜花幼苗葉片光合色素含量的影響Table 1 The contents of photosynthetic pigment of Ottelia acuminata affected by different concentrations of Cu2+

2.2 銅脅迫對海菜花幼苗抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

SOD 是植物保護(hù)系統(tǒng)中重要的酶之一，在消除氧化物自由基和減輕膜傷害方面起著重要作用［6］。由表2 可以看出，海菜花幼苗葉片中SOD 活性隨Cu2+處理濃度的增加先升高后降低。在0.01 mg/L Cu2+處理時，SOD 活性最大，比對照提高74.8%，且與對照差異顯著，超過此濃度，SOD 活性開始下降，在0.40 mg/L Cu2+處理時，達(dá)到最低，僅為對照組的16.7%，也與對照差異顯著。

經(jīng)Cu2+脅迫處理后，POD 活性的變化趨勢與SOD 一致，隨Cu2+處理濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。Cu2+濃度為0.01 mg/L時，POD 活性達(dá)最大值，比對照高46.1%;超過此濃度POD 活性開始下降，在0.40 mg/L Cu2+時，為對照組的81.6%。

與Cu2+脅迫后SOD、POD 活性變化趨勢不同，Cu2+脅迫對葉片中的CAT 活性具有明顯的抑制效應(yīng)。海菜花葉中CAT 活性隨Cu2+處理濃度的升高而降低，各處理組均與對照組差異顯著( P ＜0.05) 。當(dāng)Cu2+處理濃度0.40 mg/L時，CAT 活性僅為對照組的58.0%。

表2 Cu2+對海菜花幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響Table 2 The activity of antioxidative enzyme of O. acuminata affected by different concentrations of Cu2+

2.3 銅脅迫對海菜花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝活動的酶類，其含量是了解植物生理特征的一個重要指標(biāo)。由圖1 可知，海菜花幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量隨Cu2+脅迫濃度的增大呈先增后降趨勢，且均高于對照組，與對照差異顯著( P ＜0.05) 。Cu2+濃度0.10 mg/L處理的可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，比對照提高了85.3%。由此可見，銅脅迫處理后，海菜花幼苗葉片可能會產(chǎn)生某些抗性蛋白酶以抵御外界脅迫，減少Cu2+對植株的損傷。

2.4 銅脅迫對海菜花幼苗葉片富集銅的影響

圖1 Cu2+脅迫對海菜花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Protein contents affected by different concentrations of Cu2+

銅脅迫處理7 d 后，各處理組海菜花幼苗葉片中的Cu2+含量均高于對照組，且差異顯著( P ＜0.05) ( 圖2) 。Cu2+處理濃度0.20 mg/L時，海菜花幼苗葉片Cu2+含量達(dá)到最大值，為208.9mg/kg( 干質(zhì)量) ，其含量是對照的13.66 倍。當(dāng)Cu2+濃度為0.40 mg/L時，海菜花幼苗葉片中的Cu2+含量出現(xiàn)下降，但是葉片中的銅富集量較對照仍然很高，為對照的10.66 倍。

圖2 Cu2+脅迫對海菜花幼苗葉富集Cu2+的影響Fig.2 Cu2+ accumulation in Ottelia acuminata leaves

3 討論

植物葉片中的光合色素含量是反映植物光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，可以表征逆境脅迫因子對植物組織造成的影響［7-10］。本試驗結(jié)果表明，Cu2+脅迫顯著降低了海菜花幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量，阻礙了葉綠素的合成，抑制海菜花幼苗的生長，這與Cu2+脅迫對多花黑麥草葉綠素的影響規(guī)律一致［11］。其原因可能是: 首先，高含量Cu2+抑制了PSⅡ的電子傳遞過程，減弱了光合作用強(qiáng)度［12］，減少了葉綠素的合成;其次，Cu2+脅迫增加活性自由基的產(chǎn)生而氧化葉綠素，導(dǎo)致葉綠素含量的降低，最終引起光合速率的下降［13］;再次，可能是海菜花幼苗攝入過量的Cu2+與葉綠素合成的某些酶( 原葉綠素酸酯還原酶、膽色素原脫氨酶、8-氨基乙酰丙酸合成酶) 的-SH 結(jié)合，改變了酶的構(gòu)象，使酶失活，進(jìn)而造成光合色素含量的下降［14］。

SOD、POD 和CAT 共同組成植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，能有效地消除氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)固有的自由基代謝平衡［15］。隨著Cu2+處理濃度的增加，SOD 和POD 活性都是先上升后下降，這與Cu2+脅迫后三葉草、狗牙根、雙匯雀稗等葉片中SOD、POD酶活性變化規(guī)律一致［16］。而海菜花幼苗中CAT 活性與SOD、POD 酶活性變化規(guī)律不一樣，整體表現(xiàn)出下降趨勢。由此可見，低濃度Cu2+脅迫引起海菜花幼苗體內(nèi)自由基的增加，激活了海菜花幼苗體內(nèi)的SOD、POD 酶活性，而CAT 活性被抑制，歧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2不能有效的被CAT 清除，保護(hù)植物細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)失衡，致使海菜花幼苗生理代謝紊亂，加速其細(xì)胞的衰亡，對海菜花幼苗生長產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

在逆境條件下，植物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成會受到抑制，但會被誘導(dǎo)出一些新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生;但當(dāng)脅迫加重時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，蛋白質(zhì)合成受阻［17］。本研究中，低濃度Cu2+處理的海菜花幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量升高主要是由于抗性蛋白的產(chǎn)生，高濃度Cu2+處理時，植物細(xì)胞受損，蛋白合成受阻，可溶性蛋白質(zhì)含量下降，這與孫天國等人的研究結(jié)果一致［17］。

本研究中，在0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L和0.20 mg/L的Cu2+處理時，海菜花幼苗對Cu2+的富集量隨外源Cu2+濃度的增加而增大，當(dāng)Cu2+濃度大于0.20 mg/L時，由于海菜花幼苗的生長受到嚴(yán)重抑制，根的吸收和轉(zhuǎn)運能力降低，使葉片中Cu2+含量降低，這與可溶性蛋白質(zhì)含量的變化趨勢一致。

［1］ 王婭玲，李維峰，馬巾媛，等.銅水平對咖啡幼苗若干生理代謝指標(biāo)的影響［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34(9) :6-8，13.

［2］ 韓春梅.銅脅迫對蘿卜幼苗根系生理生化指標(biāo)的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010 (1) :179-180.

［3］ 汪 松，解 焱.中國物種紅色名錄(1 卷) ［M］.北京: 高等教育出版社，2004:412.

［4］ 李合生.植物生理生化試驗原理和技術(shù)［M］. 北京: 高等教育出版社，2000:134-136，164-169.

［5］ 張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.3 版. 北京: 高等教育出版社，2005:159-160.

［6］ 朱 健，龍 健，范菲菲.鹽酸左氧氟沙星脅迫對小麥幼苗生長及生理特性的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41( 11) :17-21.

［7］ 張治平，於丙軍，汪良駒，等. 低溫下ALA 對番茄光合色素和抗氧化酶活性的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30( 1) :222-224.

［8］ 陳宏州，楊敬輝，張文文，等. 油菜田日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈抗性的生理應(yīng)答［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29( 3) :527-532.

［9］ 呂艷偉，何文慧，陳雨鷗，等. 鹽脅迫對小麥幼苗光合色素含量和細(xì)胞膜的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(6) :74-76.

［10］ 張麗娜，孫 海，李騰懿，等. Mn2+脅迫對西洋參生理特征及某些營養(yǎng)元素吸收與分配的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(4) :192-196.

［11］ 劉大林，曹喜春，張 華.土壤Cu2+脅迫對多花黑麥草部分生理指標(biāo)的影響［J］.草地學(xué)報，2014，22(2) :319-325.

［12］ 田生科，李廷軒，楊肖娥，等.植物對銅的吸收運輸及毒害機(jī)理研究進(jìn)展［J］.土壤通報，2006，37(2) :387-393.

［13］ 張麗娜，孫 海，李騰懿，等. Fe2+脅迫對西洋參某些生理指標(biāo)的影響［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，26 (6) :2265-2270.

［14］ 王廣林，張金池，王 麗，等.銅鋅脅迫對丁香蓼生理指標(biāo)的影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，33(4) :43-47.

［15］ 李錚錚，伍鈞一，唐 亞，等. 鉛、鋅及其交互作用對魚腥草葉綠素含量及抗氧化酶系統(tǒng)的影響［J］. 生態(tài)學(xué)報，2007，27(12) :5441-5446.

［16］ 余順慧，黃怡民，潘 杰，等.銅脅迫對2 種三峽庫區(qū)消落帶適生植物生長及銅積累的影響［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27( 3) :1196-1200.

［17］ 孫天國，沙 偉，劉 巖. 復(fù)合重金屬脅迫對兩種蘚類植物生理特性的影響［J］.生態(tài)學(xué)報，2010，30(9) :2332-2339.