根際澆灌ALA 溶液對蘋果葉片生理特性與果實品質(zhì)的影響

張麗穎， 馮新新， 高晶晶， 安玉艷， 田 凡， 李 潔， 張治平， 汪良駒

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京210095;2.江蘇省豐縣臨風果蔬專業(yè)合作社，江蘇 徐州221723)

改善果實品質(zhì)始終是果樹生產(chǎn)科研中的重大課題，任何能夠提高果實品質(zhì)的技術(shù)措施都具有實踐意義和科學(xué)意義。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是一種普遍存在于動植物及微生物體內(nèi)的天然物質(zhì)，是所有卟啉化合物包括葉綠素、亞鐵血紅素、光敏素發(fā)色團等生物合成的關(guān)鍵前體［1］。大量研究結(jié)果表明，ALA 可誘導(dǎo)植物組織再生［2］，促進種子萌發(fā)［3］，提高葉片光合效率［4］，促進氮素吸收與轉(zhuǎn)化［5］，促進果實著色［6］，增強植物抵抗低溫［7］、弱光［8］、鹽漬［9］和干旱［10］等逆境的能力，因而，被認為是一種新的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)［11］。在蘋果上，汪良駒等［12］最早報道300 mg/L ALA 可以促進果實花青苷合成，提高果實外觀品質(zhì)。王中華等［6］證實了這一效應(yīng)，并且認為它與苯丙氨酸解氨酸(PAL)活性上調(diào)有關(guān)。Xie 等［13］證明，ALA 可以誘導(dǎo)蘋果果皮中與花青苷合成有關(guān)的多種基因的表達，從而促進花青苷積累。高晶晶等［14］提出，利用低濃度ALA 溶液進行葉面噴施，在提高葉片光合性能的同時改善了果實品質(zhì)。但是，ALA 對光照敏感，如果白天噴施，很可能因為光照而影響到ALA 活性。因而，改進ALA 的施用方法仍然是這種天然植物生長調(diào)節(jié)劑實際生產(chǎn)推廣的重要前提。本研究以秦陽蘋果為材料，通過根際澆灌0.1 ～10 mg/L ALA 溶液，比較不同處理對蘋果葉片葉綠素含量、葉綠素熒光特性、抗氧化活性、脂質(zhì)過氧化水平以及果實采收品質(zhì)的影響，以期為ALA 在蘋果生產(chǎn)上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2013 年4 月下旬至2013 年7 月下旬在江蘇省豐縣趙莊鎮(zhèn)田坑村優(yōu)質(zhì)蘋果密植示范園內(nèi)進行。供試蘋果樹4 年生(試驗時為結(jié)果后第2 年)，品種為秦陽，株行距2 m ×4 m，砧木為八棱海棠。試驗設(shè)0.1 mg/L、1.0 mg/L、10.0 mg/L 3 個ALA 濃度，以清水為對照，單株小區(qū)，重復(fù)5 次，隨機排列。每個小區(qū)之間均間隔1 株作為保護區(qū)。4 月底(謝花后)開始處理，以后每1 個月(即5 月底和6 月底)再施1 次，共計3 次。ALA 處理前，先將ALA(蘇州益安生物科技有限公司生產(chǎn))配成母液，然后稀釋至指定濃度，澆灌于蘋果樹盤內(nèi)，每株10 kg。處理結(jié)束后1 個月(7 月底，正值果實成熟)，選取樹冠外圍新梢中上部成熟葉片，活體測定葉綠素熒光特性。選取類似部位葉樣，用冰盒保存，盡快帶回室內(nèi)，并分為3 組，1 組測定葉綠素含量，1 組液氮速凍，保存于－80 ℃，用于抗氧化酶活性、膜脂過氧化水平測定，第3 組經(jīng)110 ℃殺青15 min，80 ℃烘至恒質(zhì)量，用于礦質(zhì)元素測定。同時，隨機采集各處理成熟果實(各100 個)，分析果實品質(zhì)。

1.2 生理生化指標測定

葉綠素快速熒光特性測定采用英國Hansatech公司生產(chǎn)的多功能植物效率儀(M-PEA)，并按照Srivastava 等［15］和孫永平等［16］的方法進行JIP-test 分析。每個處理重復(fù)測定10 ～15 張葉片，取平均值。

葉片葉綠素含量測定采用95%酒精浸提法［17］，葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法［18］測定，過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性按Change 和Maehly 法［19］測定，抗壞血酸過氧化酶(APX)活性按Mishra 法［20］測定，超氧陰離子生成速率用羥胺法［21］測定，過氧化氫(H2O2)含量按Jana 等法［22］測定，丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸法［23］測定，果皮花青素含量用鹽酸甲醇法［24］測定，可溶性固形物含量用PAL-1 手持型折光儀測定，可溶性糖用蒽酮法［25］測定，可溶性蛋白用考馬斯亮藍法［26］測定，VC含量用紫外分光光度法［27］測定，可滴定酸含量用NaOH 滴定法測定。葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素包括K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn 和Na 等含量用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法［28］測定，磷含量用鉬藍比色法［29］測定。以上測定，均重復(fù)4 次以上，取平均值，并進行方差分析和Duncan’s 測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果葉片葉綠素含量的影響

根際澆灌ALA 溶液可以提高秦陽蘋果葉片葉綠素含量(圖1)，其中，0.1 mg/L ALA 處理葉片Chl.a、Chl.b、葉綠素總量和Chl.b/Chl.a 的蘋果與對照差異均不顯著，而1.0 和10 .0 mg/L ALA 處理葉片的Chl. a、Chl. b、葉綠素總量和Chl. b/Chl. a 比值均顯著高于對照(P ＜0.05)。1.0 mg/L ALA 處理的葉片葉綠素a 比對照高出5%，葉綠素b 高出41%，葉綠素總量高出17%，Chl. b/Chl. a 高出35%。說明，根際澆灌ALA 溶液可以顯著促進蘋果葉片葉綠素特別是葉綠素b 的積累。

圖1 根際澆灌不同濃度ALA 溶液對秦陽蘋果葉片葉綠素a(A)、葉綠素b(B)、葉綠素總量(C)以及Chl.b/ Chl.a(D)的影響Fig.1 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the leaf chlorophyll a (A)，chlorophyll b (B)，total chlorophylls (C)and chlorophyll b/a in Qinyang apple trees

2.2 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果葉片葉綠素熒光特性的影響

圖2A 為ALA 處理后蘋果葉片葉綠素快速熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線，即OJIP 曲線，其中，O 相為照光后50 μs 的瞬時熒光值，J 相為2 ms 的瞬時熒光值，I相為30 ms 的瞬時熒光值，P 相為在200 ms 左右的的瞬時熒光值。從圖2A 中可以看出，ALA 處理后的OJIP 熒光值普遍高于對照，而且濃度越高，熒光值越高，說明根際澆灌ALA 溶液可以提高蘋果葉片葉綠素快速誘導(dǎo)熒光值。0.1 mg/L ALA 的熒光值略高于對照，1.0 mg/L和10.0 mg/L ALA 處理的熒光均顯著高于對照，而兩者之間沒有明顯差異。

圖2B 顯示，ALA 處理葉片PSII 反應(yīng)中心供體側(cè)放氧復(fù)合體受抑程度(Wk)顯著低于對照，其中0.1 mg/L ALA 處理比對照低6%，而1.0 mg/L和10.0 mg/L ALA處理葉片分別低13%和10%，差異均達到顯著水平(P ＜0.05)。J 相相對熒光(Vj)和PSII 反應(yīng)中心最大關(guān)閉速率(Mo)代表著PSII 反應(yīng)中心關(guān)閉狀態(tài)。從圖2B 中可以看出，ALA 處理后，蘋果葉片Vj有少量下降，但未達到差異顯著水平，而Mo顯著下降(P ＜0.05)，說明ALA 處理提高了蘋果葉片PSII 反應(yīng)中心開放程度。PSII 最大光化學(xué)效率(φP0=Fv/Fm)經(jīng)ALA 處理后也顯著上升，其中0.1 mg/L ALA 處理提高9%，而其他兩個處理提高幅度分別為15%和12% (P ＜0.05)。

如圖2C，當t=0 時，ALA 處理的蘋果葉片PSII反應(yīng)中心吸收、捕獲和熱耗散的能量(即ABS/CS、TRo/CS 和DIo/CS)與對照差異不顯著(P ＞0.05)。然而，當t=m 時(熒光值最大)，處理葉片單位面積PSII 反應(yīng)中心傳遞的能量ETo/CSm比對照高出25%-33%，捕獲能量TRo/CSm比對照高出18% ～26%，吸收能量ABS/CSm比對照高出9% ～10%，只有熱耗散DIo/CSm仍然降低9% ～13%，說明ALA 處理蘋果葉片在強光下單位面積吸收、捕獲和傳遞光能的能力顯著提高，而以非學(xué)化學(xué)形式耗散的能量份額減少。如果以有活性反應(yīng)中心為單位來計算能量吸收、熱耗散、捕獲和傳遞份額，可以看出，所有處理葉片的ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC 和ETo/RC 均小于對照，說明每一個有活性的PSII 反應(yīng)中心所吸收、捕獲、傳遞以及熱耗散的能量都因ALA 處理而下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是單位面積有活性反應(yīng)中心的數(shù)量因ALA 處理而增加。3 種ALA 處理葉片RC/CS 比對照高3% ～6%。

圖2 根際澆灌不同濃度ALA 溶液對秦陽蘋果葉片快速葉綠素熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線(A)，PSII 反應(yīng)中心活性(B)，PSII 反應(yīng)中心能量吸收、捕獲、傳遞、熱耗散特性(C)，PSI 反應(yīng)中心活性以及光合性能指數(shù)(D)的影響Fig.2 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on fast induction curves of chlorophyll a fluorescence (A)，activity of PSII reaction center (B)，characteristics of energy absorbance，trap，transfer and heat dissipation of PSII reaction center (C)，and activity of PSI reaction center and photosynthetic capacity index (D)of Qinyang apple leaves

δRo和φRo均為PSI 反應(yīng)中心活性參數(shù)，代表著光合電子從QB到PSI 反應(yīng)中心末端NADPH 的活性。從圖2D 中可以看出，ALA 處理葉片δRo和φRo均顯著低于對照，特別是δRo，只有對照的73% ～80%，說明ALA 處理可以減輕蘋果葉片PSI 反應(yīng)中心電子傳遞壓力。另外，ALA 處理葉片光合性能指數(shù)(包括以吸收為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PIABS、以葉面積為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PIcs和包括PSI 和PSII 在內(nèi)的整個性能指數(shù)PItotal)均顯著高于對照，其中PIABS比對照高出62% ～118%，PIcs比對照高出48% ～73%，PItotal比對照高出43% ～76%(P ＜0.01)。ALA 濃度越高，提高幅度越大。

2.3 根際澆灌ALA 溶液處理對秦陽蘋果葉片抗氧化酶活性的影響

表1 顯示，ALA 處理的蘋果葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性均有不同程度上升。其中，0.1 mg/L和1.0 mg/L ALA 處理后秦陽蘋果葉片SOD 活性上升了11.4%和15.4%，與對照差異達到顯著水平，但是10 mg/L ALA 處理葉片SOD 活性反而低于對照。與此不同的是，POD 活性隨著ALA濃度提高呈逐漸上升趨勢，其中10.0 mg/L ALA 處理POD 活性是對照的5.8 倍，差異達到顯著水平。低濃度ALA 處理顯著提高蘋果葉片CAT 活性，其中0.1 mg/L和1 .0 mg/L ALA 處理后蘋果葉片CAT 活性比對照高出85%和38%(P ＜0.05)，但10.0 mg/L ALA處理葉片CAT 活性反而與對照差異不顯著。0.1 mg/LALA 處理的蘋果葉片APX 活性與對照差異未達到顯著水平，1.0 mg/L和10.0 mg/L ALA 處理對APX活性的促進效應(yīng)達到顯著水平。

表1 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果葉片抗氧化活性的影響Table 1 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the antioxidant activity of Qinyang apple fruits

2.4 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果葉片活性氧及丙二醛含量的影響

圖3A 顯示，只有0.1 mg/L ALA 處理對過氧化氫含量的降低達到顯著水平(P ＜0.05)。ALA 對超氧陰離子生成速率的影響隨著濃度提高而效應(yīng)增大(圖3B)。10.0 mg/L ALA 處理葉片超氧陰離子生成速率只有對照的31%。類似地，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也是隨著ALA 濃度增加而逐漸降低(圖3C)，表明根際澆灌較高濃度的ALA 溶液可顯著降低蘋果葉片細胞膜脂質(zhì)傷害程度。

圖3 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果葉片過氧化氫(A)、超氧陰離子生成速率(B)以及丙二醛(C)含量的影響Fig.3 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the H2O2(A)，superoxide anion production rate (B)and malonaldehyde (MDA)content (C)of Qinyang apple leaves

2.5 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量的影響

表2 顯示，根際澆灌ALA 溶液將導(dǎo)致蘋果葉片P、K 和Na 含量下降，同時，Ca、Mg、Fe、Cu 和Zn 等元素含量上升。當ALA 濃度達到1.0 mg/L以上時，蘋果葉片P 含量顯著低于對照。根際澆灌ALA 溶液顯著降低了K 和Na 含量，0.1 mg/L ALA 處理后，蘋果葉片的K 和Na 含量就顯著低于對照;濃度進一步提高，含量下降幅度就更大。ALA 對蘋果葉片Ca 含量的促進效應(yīng)隨著濃度提高而增大，1.0 mg/L和10.0 mg/L的處理效應(yīng)達到差異顯著水平(P ＜0.05)。對于其他元素含量而言，0.1 mg/L、1.0 mg/L和10.0 mg/L的ALA 處理都有顯著促進效應(yīng)，其中，0.1 mg/L ALA 對Mg、Fe 和Cu 的促進效應(yīng)最大，分別比對照高出19%、52%和222%。此外，1.0 mg/L ALA 處理對蘋果葉片Zn 含量的促進效應(yīng)最大，處理葉片比對照高出42%。

表2 不同ALA 濃度處理對秦陽蘋果葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量的影響Table 2 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the leaf mineral elements of Qinyang apple

2.6 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果果實品質(zhì)的影響

表3 顯示，根際澆灌ALA 溶液可以顯著提高秦陽蘋果果皮花青苷含量，其中，0.1 mg/L 處理效應(yīng)最好，果皮花青苷含量增加123%。0.1 mg/L ALA處理可顯著提高蘋果可溶性糖、可溶性固形物、可溶性蛋白質(zhì)、維生素C 含量和果實糖酸比(P ＜0.05)，對可滴定酸含量的影響不顯著。

表3 根際澆灌ALA 溶液對秦陽蘋果內(nèi)外品質(zhì)的影響Table 3 Effect of ALA concentrations by rhizosphere application on the outside and inside quality of Qinyang apple fruits

3 討論

ALA 提高植物葉片光合性能效應(yīng)已經(jīng)有多篇研究報告［4，8，14，16］，其中大多數(shù)是葉面噴施的效果研究，而且有研究認為，根施不如葉施［30］。但是，ALA對光不穩(wěn)定，尤其是在蘋果園中，生長季節(jié)果實套塑膜袋，采收前也不解開，外源ALA 無法直接噴布到果面上，因而ALA 在套塑膜袋果園中應(yīng)用遇到障礙。假如能夠根系施用，則不僅可以防止ALA 光解，而且可以避開果袋障礙，從而更加有利于ALA在果樹生產(chǎn)上應(yīng)用。本研究結(jié)果表明，根際澆灌ALA 溶液同樣可以促進蘋果葉片葉綠素合成，提高光化學(xué)能量轉(zhuǎn)換效率。這與葉面噴施效應(yīng)相似［14］。試驗還觀察到，江蘇豐縣蘋果普遍存在著葉片黃化現(xiàn)象，而根際澆灌ALA 溶液可明顯緩解葉片黃化程度。從數(shù)據(jù)上看，根際澆灌ALA 溶液顯著提高蘋果葉片葉綠素含量，這可能與ALA 作為葉綠素生物合成的關(guān)鍵前體，參與葉綠素合成調(diào)節(jié)有關(guān)［1］，也可能與ALA 提高葉片F(xiàn)e 含量有關(guān)。另一方面，ALA顯著提高蘋果葉片Chl.b/ Chl.a 比值，說明ALA 對葉綠素b 合成的促進效應(yīng)更大。這印證了前人有關(guān)ALA 促進葉綠素a 向葉綠素b 轉(zhuǎn)化的論斷［31］。由于葉綠素b 的主要功能是吸收散射光，ALA 處理導(dǎo)致蘋果葉片葉綠素b 含量提高，有利于弱光條件下植物葉片更好地吸收散射光能。

根際澆灌ALA 可以提高蘋果PSII 反應(yīng)中心供體側(cè)、反應(yīng)中心本身以及受體側(cè)電子傳遞活性。Wk、Vj和Mo著下降，同時，φPo和Ψo顯著上升，充分說明ALA 處理對PSII 反應(yīng)中心活性的促進效應(yīng)。從光能吸收、捕獲、傳遞以及熱耗散角度看，當暗適應(yīng)葉片轉(zhuǎn)到光下(t =0 時)，ALA 處理葉片ET0/CS 有少量上升，而在充分照光(t =m)時，處理葉片TRo/CSm和ETo/CSm大幅上升，表明在強光照射下，ALA 處理葉片捕獲光能和傳遞光化學(xué)能的能力顯著提高。這是前人［14］研究報告中沒有觀察到的。由于試驗測定正值夏季高溫強光季節(jié)，強光下葉片捕獲和傳遞光能的能力提高不僅可以提高蘋果葉片對光能的吸收利用效率，而且暗示著葉片抵抗光抑制的能力增加。如果從單位反應(yīng)中心吸收、捕獲、傳遞和熱耗散角度看，幾乎所有指標(包括ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC 和DIo/RC)均因ALA 處理而下降，而有活性的反應(yīng)中心密度增大。這也與前人報道相似［14］，說明ALA 處理可以緩解強光對蘋果葉片的光抑制程度。

本研究首次將δRo和φRo運用于ALA 處理蘋果葉片PSI 反應(yīng)中心活性分析，δRo為一個電子從PSII與PSI 之間的某個電子載體(如QB)傳遞到PSI 末端電子受體NADP 上的效率，而φRo為PSI 受體末端被還原的量子效率［32］。根際澆灌ALA 導(dǎo)致蘋果葉片δRo和φRo下降，這意味著從QB傳遞來的電子只有一部分用于NADP 還原，因而PSI 反應(yīng)中心附近存在著其它電子傳遞途徑，可以接受PSII 傳遞來的電子。然而，蘋果葉片光合性能指數(shù)(包括PIABS、PIcs和PItotal)并沒有因為δRo和φRo下降而下降，相反，ALA處理葉片的性能指數(shù)明顯高于對照。這與謝荔等［33］在葡萄上觀察到的結(jié)果相似，他們提出，分布于PSI附近的SOD 可以消除PSI 反應(yīng)中心產(chǎn)生的超氧陰離子并生產(chǎn)H2O2，產(chǎn)生的H2O2通過POD、CAT 或APX等被清除，從而緩解PSI 反應(yīng)中心的光抑制，提高整個光合系統(tǒng)活力。根際澆灌ALA 同樣提高蘋果葉片抗氧化酶活性，降低超氧陰離子生成速率和丙二醛含量，因而，ALA 提高抗氧化酶活性可能是其提高葉片光合電子傳遞效率的重要原因。眾所周知，POD、CAT和APX 活性依賴于亞鐵血紅素輔基［34］，而ALA 是亞鐵血紅素生物合成的關(guān)鍵前體，外源ALA 處理可以提高萌發(fā)中小白菜幼苗亞鐵血紅素含量［3］，過量合成ALA 的轉(zhuǎn)基因擬南芥也含有更多的亞鐵血紅素［35］。因而，本研究觀察到的蘋果葉片抗氧化酶活性提高，一方面是亞鐵血紅素含量增加的結(jié)果，同時可以消除PSI 反應(yīng)中心附近的超氧陰離子，緩解光合光抑制，對PSI 和PSII 活性都有促進效應(yīng)，因而，PIABS、PIcs和PItotal均有顯著提高。

Watanabe 等［36］提出，ALA 處理可以減少鹽脅迫下棉花幼苗對Na+的吸收，而在非鹽脅迫下，ALA處理植株K+含量顯著下降。Naeem 等［9］在油菜上證實了這一現(xiàn)象。本研究結(jié)果與此類似，根際澆灌ALA 溶液可以減少蘋果葉片K+和Na+含量。除此之外，我們還觀察到，蘋果葉片P 含量因ALA 處理而下降。假如這一現(xiàn)象具有普遍性，那么果園施用ALA 時應(yīng)該適當追加磷鉀肥。本研究首次觀察到根際澆灌ALA 溶液能顯著提高蘋果葉片Ca、Mg、Fe、Cu 和Zn 等元素含量，其原因尚不清楚。最近研究結(jié)果表明，ALA 能夠顯著促進蘋果葉片氣孔開度［37］。那么，這些營養(yǎng)元素會不會在增大的蒸騰拉力作用下更多地被吸收利用是值得深入研究的。

葉面噴施ALA 溶液對果實品質(zhì)的影響已經(jīng)有不少報告。在蘋果［6，12，13］、梨［38］、桃［39］、葡萄［33］、草莓［40］上，ALA 處理均能不同程度地改善果實品質(zhì)，標志著ALA 在優(yōu)質(zhì)果品生產(chǎn)上有應(yīng)用前景。本研究提出的根際澆灌法，不僅可以降低ALA 施用濃度，而且可以運用于塑膜袋果實生產(chǎn)，同樣可以提高果實品質(zhì)，特別是促進果皮花青苷積累，從根本上解決了部分塑膜袋果實不能施用外源ALA 的難題。

綜上所述，根際澆灌0.1 ～10.0 mg/L ALA 溶液，可以促進并調(diào)節(jié)秦陽蘋果葉片葉綠素合成，提高抗氧化能力，緩解PSI 光抑制，增強光合系統(tǒng)活性，提高光合性能指數(shù)，還能提高葉片Ca、Mg、Fe、Cu 和Zn 含量，但降低P、K 和Na 含量。根灌ALA 溶液可以提高秦陽蘋果內(nèi)外品質(zhì)。

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