兒童多重耐藥腸球菌感染流行病學(xué)及耐藥基因篩選

張書(shū)婉，黃君華

(1.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021)

兒童多重耐藥腸球菌感染流行病學(xué)及耐藥基因篩選

張書(shū)婉1，黃君華2

(1.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021)

目的 了解兒童感染腸球菌的臨床分布、耐藥表型和耐藥基因的攜帶情況，為臨床合理用藥、控制院內(nèi)感染及流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。方法收集西安市兒童醫(yī)院2014年2月至2015年1月分離的腸球菌180株，用K-B法檢測(cè)12種抗菌藥物的耐藥情況，運(yùn)用多重PCR檢測(cè)aac(6')-Ie-aph9(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id、erm(B)、mef(A)、tet(M)、tet(L)等耐藥基因。結(jié)果在180株臨床分離株中屎腸球菌118株，糞腸球菌46株，其他腸球菌16株；其中分離自尿液的最多，占34.4%。藥敏結(jié)果顯示屎腸球菌對(duì)紅霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為84.7%和67.8%，高濃度慶大霉素耐藥(HLGR)菌株占83.0%；糞腸球菌對(duì)紅霉素和四環(huán)素的耐藥率為82.6%和82.6%，HLGR菌株占73.9%；未發(fā)現(xiàn)利奈唑胺和萬(wàn)古霉素耐藥菌株。140株HLGR腸球菌中aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia檢出率為92.8%，aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id均為陰性。150株紅霉素耐藥菌株中erm(B)基因的檢出率為66.6%，未檢測(cè)到mef(A)基因。126株四環(huán)素耐藥菌株中，tet(M)和tet(L)的檢出率分別為98.4%和80.9%。結(jié)論兒童腸球菌感染主要由屎腸球菌和糞腸球菌引起，且以尿路感染最為常見(jiàn)；多重耐藥情況嚴(yán)重，耐藥性由多基因支配，HLGR為醫(yī)院感染的重要耐藥菌，主要通過(guò)aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因介導(dǎo)；紅霉素的耐藥性主要通過(guò)erm(B)基因介導(dǎo)；四環(huán)素的耐藥基因以tet(M)和tet(L)多見(jiàn)。

兒童；腸球菌；流行病學(xué)；多重耐藥；耐藥基因

近年來(lái)隨著廣譜抗菌藥物的不合理使用，介入性診療手段和免疫抑制劑的大量應(yīng)用，腸球菌所導(dǎo)致的感染不斷增加，已成為兒童醫(yī)院感染的主要病原菌[1]，多重耐藥腸球菌的耐藥問(wèn)題也越來(lái)越引起人們的關(guān)注[2]。因此，針對(duì)腸球菌的流行病學(xué)分析和耐藥監(jiān)測(cè)顯得至關(guān)重要。本研究收集西安市兒童醫(yī)院住院患兒180份腸球菌菌株，對(duì)兒童腸球菌感染流行情況、藥敏結(jié)果和耐藥基因進(jìn)行分析，旨在為兒童腸球菌的預(yù)防及臨床合理使用抗生素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 西安市兒童醫(yī)院2014年2月至2015年1月住院患兒送檢標(biāo)本，經(jīng)VITEK compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀鑒定為腸球菌，共180株。

1.2 試劑 Mueller-Hinton瓊脂、Mueller-Hinton肉湯購(gòu)自上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)有限公司。腸球菌瓊脂、腸球菌肉湯購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。慶大霉素、呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀、四環(huán)素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、氨芐西林/舒巴坦、左氧氟沙星、氯霉素、利奈唑胺、青霉素、氨芐西林購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的K-B藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，判讀標(biāo)準(zhǔn)以臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2010年制定的規(guī)程進(jìn)行。質(zhì)控菌株糞腸球菌ATCC 29212和金黃色葡萄球菌ATCC 25923與檢測(cè)菌株平行進(jìn)行藥敏測(cè)定。

1.4 腸球菌DNA的提取及耐藥基因的檢測(cè) 應(yīng)用Bacterial DNA Extraction Mini Kit法(TIANGEN，China)，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id基因引物參照文獻(xiàn)[3]，erm(B)、mef(A)、tet(L)、tet(M)基因引物分別參照文獻(xiàn)[4-6]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和條件：10×buffer 2.5μl，10 mmol/L dNTP 0.25μl，25 mmol/L MgCl22.5μl，3.3μmol/L引物各0.5μl，Taq酶(5 U/μl)0.125μl，DNA模板1μl，ddH2O 17.625μl。PCR熱循環(huán)參數(shù)：aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id基因：94℃預(yù)變性10 min，然后94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環(huán)35周期，最后72℃延長(zhǎng)至5 min。erm(B)、tet(L)、tet(M)基因：95℃預(yù)變性5 min，然后93℃1 min，52℃1min，72℃1 min，循環(huán)30周期，最后72℃延長(zhǎng)至5 min。mef(A)基因：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃40 s，52℃40 s，72℃1 min，循環(huán)30個(gè)周期，最后72℃延長(zhǎng)至5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。隨機(jī)挑取部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 腸球菌分布特征 臨床標(biāo)本中共分離腸球菌180株，其中屎腸球菌118株(占65.6%)，糞腸球菌46株(占25.6%)，其他腸球菌16株(占8.9%)，包括鶉雞腸球菌8株，鉛黃腸球菌6株和棉子糖腸球菌2株。180株腸球菌分布于不同科室，見(jiàn)表1。180株樣本在各種標(biāo)本中所占的比例也不同，其中尿液中檢出最多，其次為引流液，其他種類(lèi)較少，見(jiàn)表2。

表1 180株腸球菌臨床分離株的科室分布(株)

表2 180株腸球菌在臨床標(biāo)本中的分布[株(%)]

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)180株腸球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，觀(guān)察其對(duì)12種常用抗菌藥物的耐藥情況，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 腸球菌分離株對(duì)12種抗生素的藥敏率(%)

2.3 腸球菌的多重耐藥性 180株腸球菌中對(duì)10種抗菌藥物耐藥的為2例屎腸球菌，占1.1%；對(duì)9種抗菌藥物菌耐藥的為10例屎腸球菌，占5.6%；對(duì)7種抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株所占比例最高，為36.7%(66/180)；其次為耐6種和5種抗菌藥物的菌株，所占比例分別為13.3%(24/180)和11.1%(20/ 180)，見(jiàn)表4。

2.4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 118株屎腸球菌陽(yáng)性耐藥基因檢測(cè)結(jié)果為：在98株慶大霉素高水平耐藥菌株中，aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的檢出率為95.9%，未檢測(cè)到aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因；20株慶大霉素敏感屎腸球菌中6株也檢測(cè)到了aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因，檢出率為30.0%。150株對(duì)紅霉素耐藥的屎腸球菌中，erm(B)基因的檢出率為66.6%，未檢測(cè)到mef(A)基因。126株對(duì)四環(huán)素耐藥的屎腸球菌中，tet(M)和tet(L)基因的檢出率分別為98.4%和80.9%。34株慶大霉素高水平耐藥菌株中，aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的檢出率為88.2%，未檢測(cè)到aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因。38株對(duì)紅霉素耐藥的糞腸球菌中，erm(B)基因的檢出率為94.7%，未檢測(cè)到mef(A)基因。38株對(duì)四環(huán)素耐藥的糞腸球菌中，tet(M)和tet(L)基因的檢出率分別為100.0%和52.6%，見(jiàn)表5。16株除屎腸球菌和糞腸球菌以外的腸球菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表6。

表4 腸球菌的耐藥種數(shù)和構(gòu)成比(%)

表5 屎腸球菌耐藥菌株和敏感菌株耐藥基因檢出率以及糞腸球菌耐藥基因檢出率

表6 16株其他腸球菌耐藥菌株和敏感菌株耐藥基因檢出率

3 討論

本研究共收集180株腸球菌，來(lái)自多個(gè)臨床科室，可見(jiàn)腸球菌廣泛分布于醫(yī)院環(huán)境內(nèi)。同時(shí)，屎腸球菌和糞腸球菌存在于多種不同性質(zhì)的標(biāo)本來(lái)源中，包括尿液、引流液、肺泡灌洗液、血液、膽汁、腹水、腦脊液等，也進(jìn)一步證明腸球菌可以在人體不同環(huán)境內(nèi)存在，一定條件下可以導(dǎo)致機(jī)體各個(gè)部位的感染。180株腸球菌中分離自尿液的最多，占34.4%(62/180)；其次分離于引流液，占25.6%(46/180)；肺泡灌洗液和血液來(lái)源的均居第三位，占6.7%(12/180)；腹水來(lái)源居第五位，占5.6%(10/180)。由此可推斷，在腸球菌所致的感染中以尿道感染最常見(jiàn)，這與歐陽(yáng)彬[7]的報(bào)道較一致。在所分離的腸球菌中屎腸球菌和糞腸球菌的分離率最高，分別為65.6%(118/180)和25.6%(46/180)，共占總數(shù)的91.2%(164/180)，且屎腸球菌的分離率明顯高于糞腸球菌，而成人醫(yī)院則以糞腸球菌為主[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的12種抗菌藥物中，屎腸球菌和糞腸球菌的耐藥譜和耐藥率不同。118株屎腸球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、紅霉素、氨芐西林/舒巴坦、高水平慶大霉素和左氧氟沙星的耐藥率均高于80%；46株糞腸球菌則對(duì)四環(huán)素、紅霉素和奎奴普丁/達(dá)福普汀的耐藥率處于高水平，均高于80%。糞腸球菌對(duì)奎奴普丁/達(dá)福普汀的耐藥率達(dá)87.0%，而屎腸球菌對(duì)其的耐藥率僅為10.2%；屎腸球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(青霉素、氨芐西林)的耐藥率明顯高于糞腸球菌；未發(fā)現(xiàn)對(duì)利奈唑胺和萬(wàn)古霉素耐藥菌株。整體分析，兩種細(xì)菌對(duì)紅霉素和高水平慶大霉素的耐藥率均高于60%，與李爽等[9]的報(bào)道一致，可能與這兩種抗生素作為臨床常用藥在臨床的長(zhǎng)期應(yīng)用密切相關(guān)。在這180株樣本中，對(duì)7種抗生素同時(shí)耐藥的菌株占總數(shù)的36.7%(66/180)，其次為同時(shí)耐受6種和5種抗生素的菌株，所占比例分別為13.3%(24/180)和11.1%(20/180)?？傮w分析180株樣本，對(duì)4種及以上抗生素同時(shí)耐藥的菌株高達(dá)84.5%(152/180)，提示應(yīng)加強(qiáng)措施控制多重耐藥腸球菌的蔓延。

近年來(lái)關(guān)于腸球菌耐藥基因的檢測(cè)或耐藥基因作用機(jī)制的研究較多，不同來(lái)源，不同種屬的腸球菌在耐藥基因的檢出率上存在較大的差異，這可能與地區(qū)、人群或標(biāo)本等的構(gòu)成不同有關(guān)。本研究得到耐高濃度慶大霉素(HLGR)菌株140株，在這些菌株中aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的檢出率為92.8%。而在180株腸球菌中均未檢出aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因，提示aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的存在是導(dǎo)致HLGR發(fā)生的主要原因，這與其他國(guó)內(nèi)研究結(jié)果相一致[10]。有10株HLGR未能檢測(cè)到以上四種氨基糖苷類(lèi)耐藥基因，提示其耐藥機(jī)制可能由其他耐藥基因介導(dǎo)。150株對(duì)紅霉素耐藥腸球菌中，erm(B)基因的檢出率為66.6%，未檢測(cè)到mefA基因，提示腸球菌對(duì)紅霉素的耐藥性可能主要由erm(B)基因介導(dǎo)，且糞腸球菌中erm(B)的檢出率(94.7%)明顯高于屎腸球菌(60.0%)。126株四環(huán)素耐藥腸球菌中，tet(M)基因陽(yáng)性率為98.4%，tet(L)基因陽(yáng)性率為80.9%；在38株耐四環(huán)素的糞腸球菌中，tet(M)基因的檢出率為100.0%，可見(jiàn)四環(huán)素藥敏表型與tet(M)基因型在糞腸球菌中有很高的符合率，而tet(L)基因的檢出率僅為52.63%(20/38)；在80株耐四環(huán)素的屎腸球菌中，tet(M)基因型與tet(L)基因型與四環(huán)素藥敏表型的符合率分別為97.5%(78/80)和92.5%(74/80)，同樣處于較高水平。值得提及的是，在28株對(duì)高水平慶大霉素敏感的腸球菌中，有8株檢測(cè)出攜帶有aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因；同樣，在38株對(duì)四環(huán)素敏感的屎腸球菌中，分別由4株和6株攜帶有tet(M)基因和tet(L)基因。這種表型與基因型不一致可能為基因突變或基因的表達(dá)受抑制所致，其內(nèi)在機(jī)制需進(jìn)一步討論研究。

綜上所述，腸球菌是兒童院內(nèi)感染的常見(jiàn)病原菌，以屎腸球菌為主，且主要為尿路感染。腸球菌多重耐藥情況嚴(yán)重，同一菌株攜帶多種耐藥基因的頻率較高，警示我們要合理使用抗菌藥物，減少細(xì)菌耐藥。

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Clinical epidemiology and antibiotic resistant genes of multidrug-resistant Enterococcus isolated from infected children.

ZHANG Shu-wan1,HUANG Jun-hua2.1.Department of Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi’an 710003,Shaanxi,CHINA;2.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical epidemiological trend and antibiotic resistant pattern of Enterococci isolated from infected children in order to guide the rational use of antibiotics and effective surveillance of nosocomial infections.MethodsOne hundred and eighty strains of Enterococci isolated from infected children in Xi'an Children's Hospital from February 2014 to January 2015 were collected and analyzed for epidemiological distribution and antibiotic susceptibility profile by K-B Method.Multiplex polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the resistance genes for gentamycin[aac(6')-Ie-aph9(2'')-Ia,aph(2'')-Ib,aph(2'')-Ic,aph(2'')-Id],erythromycin[erm (B),mef(A)],tetracycline[tet(M),tet(L)].ResultsAmong the 180 isolates,which were mainly from urine(34.4%), there were 118 strains ofEnterococcus faecium,46 strains ofE.faecalisand 16 strains ofEnterococci spp(8.9%).Antibiotic susceptibility of Enterococci against 12 antibiotics was determined by K-B method.High-level gentamycin resistance(HLGR)was present in 83.0%ofE.faeciumand 73.9%ofE.faecalisisolates.Resistance to erythromycin and tetracycline was highly prevalent inE.faecium(84.7%and 67.8%,respectively)andE.faecalis(82.7%and 82.6%,respectively).Among the 140 HLGR isolates,the most prevalent resistant determinant was aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (92.9%),while none of the isolates harboredaph(2'')-Ib,aph(2'')-Ic oraph(2'')-Id.The erm(B)gene was responsible for erythromycin resistance in 66.6%of the erythromycin resistant enterococcal isolates,while other erythromycin resistant genes were not detected.Thetet(M)andtet(L)genes were successfully amplified from 98.4%and 80.9%of tetracycline resistant isolates,respectively.There was no linezolid and vancomycin resistance.ConclusionEnterococci are important nosocomial pathogens withE.faeciumandE.faecalisspecies most commonly isolated from clinical specimens in children.Urinary tract infection is the most common infection of Enterococcus for children.HLGR has become the important antibiotic resistance bacteria,which results in nosocomial infection,and theaac(6')-Ie-aph(2")-Ia gene is the main aminoglycoside-modifying enzyme gene which causes HLGR.erm(B)is the most prevalent genotype in the erythromycin resistant isolates,while harbouringtet(M)andtet(L)is the cause of tetracycline resistance.

Children;Enterococcus;Epidemiology;Multidrug resistance;Resistance genes

R725.7

A

1003—6350（2015）17—2554—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0925

2015-03-01)

張書(shū)婉。E-mail：shuwan0103@163.com