益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清對兔骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖和成骨分化的影響?

郭楊，馬勇，△，成吉華，趙丹，沈李李，王培民

(1.南京中醫(yī)藥大學骨傷研究所，南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京210029)

益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清對兔骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖和成骨分化的影響?

郭楊1，馬勇1，2△，成吉華1，趙丹1，沈李李1，王培民2

(1.南京中醫(yī)藥大學骨傷研究所，南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京210029)

目的:觀察益腎通絡(luò)含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影響。方法:分離BMSCs分為對照組(A組)、低濃度組(B組)、中濃度組(C組)、高濃度組(D組)、陽性對照組(E組)，干預(yù)后檢測細胞增殖和成骨分化情況。結(jié)果: CCK-8:干預(yù)24 h、72 h后B、C、D組均高于A組，干預(yù)120 h后B組高于A、C、D組。ALP活性干預(yù)7、14 d后B、C、D組高于A組，但低于E組。結(jié)論:益腎通絡(luò)含藥血清能促進BMSCs體外增殖并誘導(dǎo)其成骨分化。

益腎通絡(luò);骨髓間充質(zhì)干細胞;細胞增殖;成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)由于其具有自我更新能力且易分離、多向分化潛能等特性，為修復(fù)各種類型的骨缺損及治療股骨頭壞死開拓了寬闊的前景，成為眾多學者關(guān)注的焦點。近年來有研究表明［1］，中醫(yī)藥可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化。本實驗采用以益腎通絡(luò)為主的中藥復(fù)方，探尋其對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的影響，以進一步研究其作用機制。

1 材料

1.1 實驗對象

健康2周齡純種新西蘭大白兔1只，體質(zhì)量186 g;健康3月齡純種新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量2.5 kg，由南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(動物合格證號SCXK(蘇)2012-008)。

1.2 主要實驗試劑

益腎通絡(luò)復(fù)方:鹿角膠20 g，骨碎補20 g，三七粉15 g，水蛭15 g，土鱉蟲15 g，黃芪15 g，當歸15 g，枸杞子15 g，地龍12 g，雞血藤12 g，杜仲12 g，白術(shù)10 g，白芍10 g，桑寄生10 g，淫羊藿10 g，甘草5 g，共16味中藥(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供);Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所);堿性磷酸酶活性測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要器材與儀器

倒置式系統(tǒng)相差顯微鏡(日本Olympus); ELx800酶標儀(美國BioTek);低速離心機(德國Heraeus);JY88-IIN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清的制備

取健康3月齡純種新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量2.5 kg，按隨機數(shù)字表法分為灌胃組和對照組每組各2只，灌胃組按7.2 g/kg·d給藥益腎通絡(luò)復(fù)方濃縮液(相當于含生藥量1 g/ml)，對照組按7.2 g/kg· d劑量灌服生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d，于最后1次灌胃后1 h行麻醉下頸動脈取血，4℃靜置過夜后3000 r/min離心20 min，分離上層血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm針頭式過濾器過濾血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)

2.2.1 原代細胞培養(yǎng)取健康2周齡純種新西蘭大白兔1只，空氣栓塞處死，無菌條件下剝離出股骨、脛骨，剪斷兩端骨骺，用20 ml注射器吸取PBS溶液反復(fù)沖洗骨髓腔和干骺端，直至骨髓腔變白，收集沖洗溶液至離心管內(nèi)，1200 r/min離心5 min棄上清液，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基吹打重懸，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，7 d后換液。棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d換1次液，待細胞鋪滿皿底80%～90%時，按照1∶3進行傳代培養(yǎng)。

2.2.2 傳代細胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)步驟:待細胞生長增殖并鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時，棄原培養(yǎng)基加入PBS沖洗2次，加入胰酶-EDTA消化液，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變圓，呈懸浮游離狀，立即加入10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min棄上清液，加入培養(yǎng)基吹打重懸，分別接種于3個培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

2.3 細胞增殖活性檢測

選用第3代BMSCs細胞，以1×104/ml細胞密度、100 μL/孔接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組(A組)、低濃度組(B組)、中濃度組(C組)和高濃度組(D組)，每組5個復(fù)孔培養(yǎng)24 h后，空白對照組加入含10%對照血清培養(yǎng)基，低、中、高濃度組分別加入5%、10%、15%含藥血清培養(yǎng)基，參照CCK-8試劑說明書，于干預(yù)24 h、72 h、120 h進行細胞增殖活性檢測，酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD值)。

2.4 堿性磷酸酶活性檢測

選用第三代BMSCs細胞，以5×104/ml細胞密度，1 ml/孔接種于2塊24孔培養(yǎng)板，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組(A組)、低濃度組(B組)、中濃度組(C組)、高濃度組(D組)、陽性對照組(E組)，每組4個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，對照組加入含10%對照血清培養(yǎng)基，低、中、高濃度組分別加入5%、10%、15%含藥血清培養(yǎng)基，陽性對照組加入成骨誘導(dǎo)液(含10%空白兔血清、10-8mmol/L地塞米松﹑10 mmol/L β-甘油磷酸鈉﹑50 mg/L維生素C的培養(yǎng)基)，于干預(yù)第7、14天棄培養(yǎng)基，用胰酶-EDTA消化后，超聲破碎細胞(冰水浴，每3～5 s超聲1次，間隔4次)，參照說明書進行堿性磷酸酶活性檢測。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，不滿足方差分析條件時釆用Wilcoxon秩和檢驗，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05為差異無統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 原代和傳代細胞形態(tài)學觀察

原代培養(yǎng)7 d見散在少量貼壁細胞，呈梭形、多角形或不規(guī)則狀，周圍有大量雜質(zhì)圓形細胞(圖1-A);傳代1次培養(yǎng)后貼壁細胞數(shù)量明顯增多，細胞呈梭形、多角形，雜質(zhì)細胞明顯減少(圖1-B);第2次傳代后細胞增殖快，呈多角形或不規(guī)則狀，培養(yǎng)5 d即可鋪滿皿底(圖1-C);至第3代BMSCs細胞外觀呈長梭形，呈緊密排列，符合BMSCs細胞生長形態(tài)特征(圖1-D)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞原代和傳代細胞形態(tài)學觀察

3.2CCK-8細胞增殖結(jié)果

表1顯示，干預(yù)24 h后各濃度含藥血清組OD值大于空白對照組(P=0.011，0.000，0.000＜0.05)，其中中濃度和高濃度組OD值高于低濃度組(P=0.002，0.000＜0.01);干預(yù)72 h后，各濃度含藥血清組OD值均大于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000，0.000，0.001＜0.01)，各濃度組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);干預(yù)120 h后，低濃度組高于空白對照組、中濃度和高濃度組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001，0.004，0.000＜0.01)。

3.3 堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果

表2顯示，干預(yù)7、14 d后，各濃度組和陽性對照組堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000＜ 0.01)，各濃度組之間ALP活性隨著濃度升高而增大(P=0.000＜0.01)，陽性對照組ALP活性高于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000＜0.01)。

表1 CCK-8比色法檢測益腎通絡(luò)含藥血清對BMSCs增殖的影響(±s)

表1 CCK-8比色法檢測益腎通絡(luò)含藥血清對BMSCs增殖的影響(±s)

注:與對照組比較:△P＜0.01，△△P＜0.05;與低濃度組比較:▲P＜0.01

組別例數(shù)OD 值24 h72 h120 h空白對照組(A組)52.6176±0.03912.9554±0.04403.0748±0.1333低濃度組(B組)52.7046±0.0279△△3.1070±0.0537△3.3260±0.0639△中濃度組(C組)52.8140±0.0589△▲3.1142±0.0288△3.1266±0.0582▲高濃度組(D組)52.8868±0.5741△▲3.0616±0.0433△2.9930±0.0966▲

表2 益腎通絡(luò)含藥血清對BMSCs堿性磷酸酶活性的影響(±s)

表2 益腎通絡(luò)含藥血清對BMSCs堿性磷酸酶活性的影響(±s)

注:與空白對照組比較:△P＜0.01;與陽性對照組比較:▲P＜0.01

組別例數(shù)堿性磷酸酶(U/gprot) 7 d14 d空白對照組(A)40.4380±0.02390.3387±0.0035低濃度組(B)40.9377±0.0350△0.6341±0.0217△中濃度組(C)41.0462±0.0533△0.8729±0.0452△高濃度組(D)41.2368±0.0114△1.0098±0.0346△陽性對照組(E)41.5002±0.0434△▲1.2986±0.0482△▲

4 討論

CCK-8法是利用水溶性四唑鹽WST-8被細胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臢染料，能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臢量與活細胞數(shù)量呈正比，被認為是正確評價細胞增殖情況的一種客觀指標。本實驗發(fā)現(xiàn)，干預(yù)24 h、72 h后各濃度含藥血清組比較，空白對照組均能促進BMSCs的增殖，24 h低濃度含藥血清的增殖效應(yīng)低于中、高濃度組，但隨著時間增加，低濃度含藥血清增殖效應(yīng)高于空白對照組、中濃度和高濃度組，說明低濃度含藥血清具有穩(wěn)定促進BMSCs體外增殖的作用。

ALP作為成骨細胞分化的早期標志物，在基質(zhì)合成期開始出現(xiàn)，鈣化期達到高峰［2］，是成骨細胞分化成熟的標志性酶之一，能夠反映成骨細胞合成I型膠原、形成骨基質(zhì)的能力［3］，故其可作為成骨細胞功能狀態(tài)的一個重要指標來衡量MSCs成骨分化的程度［4］。本實驗選用其作為觀察益腎通絡(luò)復(fù)方促BMSCs成骨分化的實驗指標，結(jié)果證實，益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清具有成骨誘導(dǎo)作用，其效應(yīng)隨著含藥血清濃度而增加，但其效應(yīng)弱于成骨誘導(dǎo)液，表明益腎通絡(luò)含藥血清能在一定程度上促進BMSCs體外成骨分化。

骨髓間充質(zhì)干細胞具有成骨分化的特性，這與中醫(yī)“腎藏精，精生髓，髓生骨”的理論相吻合，因為骨髓間充質(zhì)干細胞來自于骨髓，而在特定條件下能向成骨轉(zhuǎn)化，即實現(xiàn)“髓生骨”，因此BMSCs屬于中醫(yī)學“髓”的范疇。本實驗采用的益腎通絡(luò)方是江蘇省中醫(yī)院許建安教授治療股骨頭壞死的臨床驗方［5］。本方重用鹿角膠、骨碎補溫補腎陽，三七粉、水蛭、土鱉蟲、地龍活血通絡(luò)，黃芪、白術(shù)、當歸、枸杞子、雞血藤補氣血、調(diào)經(jīng)絡(luò)，杜仲、桑寄生、淫羊藿補肝腎強筋骨，白芍、甘草緩急止痛。近年來有學者研究發(fā)現(xiàn)，10%菟絲子含藥血清有促進MSCs增殖的作用，可能與其促進BMP-2 mRNA表達有關(guān)［6］。徐凌霄等［7］研究表明，大鼠間充質(zhì)干細胞經(jīng)左歸丸含藥血清誘導(dǎo)后可以分化為成骨細胞，能夠促使誘導(dǎo)過程中堿性磷酸酶含量表達增加。閆寶勇等［8］研究表明，補腎壯骨中藥可以調(diào)節(jié)成骨細胞分泌OPG、RANKL的功能，從而降低破骨細胞的活力，促進成骨過程。

從上述結(jié)果可以看出，益腎通絡(luò)復(fù)方可能是以BMSCs為作用靶點，通過促進其增殖和成骨分化，增加成骨細胞的數(shù)量和活性，促進骨形成，從而達到防治股骨頭壞死的作用，這也為從干細胞角度研究中藥防治股骨頭壞死的機制提供了實驗依據(jù)。

［1］楊鋒，唐德志，卞琴，等.中藥誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011(10):1847-1850.

［2］Kihara T，Oshima A，Hirose M，et al.Tree-dimensional visualization analysis of in vitro cultured bone fabricated by rat marrowmesenchymalstemcells［J］.Biochemicaland Biophysical Research Communications，2004，316:943.

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［5］潘文明，許建安.自擬方治療股骨頭無菌性壞死20例報道［J］.遼寧中醫(yī)學院學報，2006，8(2):75

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Effect of Yishen Tongluo Prescription Containing Serum on the Osteogenic Differentiation of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

GUO Yang1，MA Yong1，2△，CHENG Ji-hua1，ZHAO Dan1，SHEN Li-li1，WANG Pei-min2
(1．Institute of Traumatology＆Orthopedics，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 2．Department of Traumatology＆Orthopedics，Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To observe the effect of serum containing Yishen Tongluo decoction on proliferation and osteogenic differentiation of the bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in vitro.Methods:To isolate and culture the BMSCs in vitro.The cells were randomly divided into blank control group(A group)，low-concentration group(B group)，medium-concentration group(C group)，high-concentration group(D group)，and positive control group(E group).Observing the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs.Results:CCK-8:Intervention after 24 h，72 h，OD value of B，C，D group were greater than A group;Intervention after 120 h，OD value of B group greater than A，C，D group.ALP activity results:intervention after 7d，14 d，B，C，D group were higher than A group，but lower than E group.Conclusion:Serum containing Yishen Tongluo decoction can promote the proliferation of BMSCs in vitro and induce the osteogenetic differentiation at the same time.

Yishen Tongluo;Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs);Cell Proliferation;Osteogenic differentiation

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0508-03

2015-02-09

江蘇省“六大人才高峰”資助項目(2011-WS039D)-益腎通絡(luò)法干預(yù)自體骨髓間充質(zhì)干細胞治療激素性股骨頭缺血性壞死的研究;江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(LZ09039)-中藥干預(yù)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細胞治療激素性股骨頭缺血性壞死的實驗研究;南京中醫(yī)藥大學2013年大學生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目-益腎通絡(luò)復(fù)方含藥血清對兔骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖及成骨活性影響的實驗研究

郭楊(1985-)，男，江蘇宿廷人，教師，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)病的臨床與研究。

△通訊作者:馬勇(1963-)，男，江蘇揚中人，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療骨關(guān)節(jié)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，Tel:15061529758，E-mail:cjhtcm@126.com。