蚤休復(fù)方對T N B S誘導(dǎo)炎癥性腸病小鼠的治療作用及其機(jī)制研究

王 卯 陳玉根 楊柏霖 王 瓊 周錦勇 吳 靜

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

炎癥性腸病 （Inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性病變，包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）。近年來，IBD發(fā)病率呈上升趨勢，大部分IBD患者需終身治療，而臨床主要治療藥物如糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸、免疫抑制劑和抗腫瘤壞死因子抗體副作用較多，多數(shù)患者不能長期堅持治療，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展[1-2]。因此，開發(fā)安全有效的IBD新藥具有重要意義。國醫(yī)大師徐景藩教授是學(xué)貫中西的臨床大家，他充分了解炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制及病程，在辨證論治的基礎(chǔ)上，對于病程較長，反復(fù)腹痛、腹瀉、發(fā)熱，反復(fù)出現(xiàn)腸梗阻等并發(fā)癥，以及腸鏡提示腸腔狹窄的病例每多選用蚤休、青蒿、鴨跖草、紫草、露蜂房、白芷、地錦草等藥，取得了較好的療效。本研究總結(jié)徐景藩教授治療炎癥性腸病經(jīng)驗方蚤休復(fù)方，利用三硝基苯碳酸（TNBS）誘導(dǎo)建立小鼠IBD模型，采用臨床治療IBD常規(guī)用藥柳氮磺吡啶作為對照，研究蚤休復(fù)方對炎癥性腸病的治療作用及其作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑 蚤休復(fù)方提取物 （蚤休∶青蒿∶鴨跖草∶紫草∶地錦草∶露蜂房∶白芷=2∶3∶6∶3∶3∶2∶2）由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供。將所有藥材 （15劑，約1600g）加入約10倍量水中浸潤30min，分2次水煮提取。第1次煮沸后在微沸狀態(tài)下煎煮60min，過濾得濾液；剩余藥渣再次加入10倍量水微沸狀態(tài)下煎煮40min，過濾得濾液；合并2次濾液，加熱濃縮至體積約1500mL，得濃度為1g生藥/mL的濃縮水提物，分裝，4℃條件下保存待用。三硝基苯磺酸（Picrylsulfonic acid solution，TNBS），SIGMA 公 司 ；柳氮磺吡啶，上海中西三維藥業(yè)有限公司；便隱血（OB）試劑盒，珠海貝索生物技術(shù)有限公司；MILLIPLEXRMAP的小鼠細(xì)胞因子/趨化因子磁珠試劑盒，美國Millipore公司。

1.2 實驗動物 BALB/c小鼠80只，18～22g，雌雄各半，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2012-0004。

1.3 實驗儀器 MAGPIX多重磁珠酶免分析平臺，美國Millipore公司。

2 實驗方法

2.1 小鼠實驗分組及模型建立 80只小鼠隨機(jī)分為4組（n=20）：正常對照組、模型組、柳氮磺吡啶組和蚤休復(fù)方組。正常對照組不造模，正常飼養(yǎng)。模型組、柳氮磺吡啶組、蚤休復(fù)方組小鼠參照文獻(xiàn)[3]方法，于實驗前剃毛，皮膚外涂TNBS 3.75mg（48%乙醇溶解），分別于外涂TNBS后的第7、14、21天直腸給予 TNBS 0.75mg、1.5mg、2.25mg（40%乙醇溶解），誘導(dǎo)IBD小鼠模型。

2.2 藥物干預(yù) 藥物干預(yù)與造模同時進(jìn)行。蚤休復(fù)方組給予10g/kg蚤休復(fù)方提取物灌胃，柳氮磺吡啶組給予0.5g/kg柳氮磺吡啶灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃給藥28d。

2.3 觀察指標(biāo) 每日記錄小鼠體重、糞便性狀、便隱血，參考文獻(xiàn)[4]方法，對小鼠進(jìn)行疾病活動指數(shù)（DAI）評分，并記錄死亡情況。實驗結(jié)束時處死小鼠，取結(jié)直腸稱重，測量長度和重量。取結(jié)直腸組織進(jìn)行結(jié)腸炎癥病理評分，隨后10%福爾馬林固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察，參考文獻(xiàn)評判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸炎癥組織病理學(xué)評分[5]。小鼠取血，利用多水平自動化和高通量的磁珠法篩選，即以MILLIPLEXR MAP的小鼠細(xì)胞因子/趨化因子磁珠試劑盒定量檢測32種細(xì)胞因子和趨化因子。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組小鼠存活率比較 正常對照組小鼠實驗過程中未出現(xiàn)死亡，存活率為100%；模型組小鼠終點生存率為70%，與正常對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.02683）；柳氮磺吡啶組及蚤休復(fù)方組小鼠終點生存率均較模型組高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠存活率比較

3.2 各組小鼠結(jié)腸重量/長度比值比較 TNBS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠結(jié)腸重量/長度的比值升高，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；柳氮磺吡啶能顯著降低IBD模型小鼠升高的結(jié)腸重量/長度比值（P＜0.01）；蚤休復(fù)方組結(jié)腸重量/長度比值較模型組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸重量/長度比值比較

3.3 各組小鼠疾病活動指數(shù)比較 TNBS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠DAI指數(shù)較正常對照組明顯升高（P＜0.01）；柳氮磺吡啶和蚤休復(fù)方組小鼠DAI指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。見表 3。

表3 各組小鼠疾病活動指數(shù)比較

3.4 各組小鼠結(jié)腸病變情況及病理評分比較 如圖1所示，正常對照組小鼠結(jié)腸未見明顯病變；模型組小鼠結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度為輕度或中度，多數(shù)累及黏膜層和黏膜下層，個別累及肌層，多數(shù)見隱窩損害；柳氮磺吡啶組結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度較模型組明顯減輕，病變均局限于黏膜層，無隱窩損害；蚤休復(fù)方組結(jié)腸炎癥較模型組減輕，炎細(xì)胞類型同前，病變均局限于黏膜層，均無隱窩損害。病理評分結(jié)果見表4。與正常對照組比較，模型組小鼠病理評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和蚤休復(fù)方組小鼠病理評分均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。

圖1 各組小鼠結(jié)腸病理圖片（HE染色，×200）

表4 各組小鼠病理評分比較 分

3.5 各組小鼠細(xì)胞因子血清水平比較 檢測了32種細(xì)胞因子和趨化因子，與模型組比較，蚤休復(fù)方組小鼠血清IL-12 P70明顯增加 （P=0.030），CCR5配體 MIP-1ɑ明顯減少（P=0.045），而 CXCR3配體CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）血清水平顯著增加（P=0.006，P=0.027）。

表5 各組小鼠IL-12 P70、IP-10、MIP-1ɑ及MIG表達(dá)水平比較

4 討論

目前炎癥性腸病的發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為可能與免疫、感染、環(huán)境、遺傳等多種因素相關(guān)。西醫(yī)治療IBD以控制炎癥、緩解癥狀為主，多采用氨基水楊酸類藥物，如柳氮磺吡啶，主要有效成分為5-氨基水楊酸，與腸壁結(jié)締組織絡(luò)合后較長時間停留在腸壁組織中起到抗菌消炎和免疫抑制作用，同時抑制前列腺素的合成以及其他炎癥介質(zhì)白三烯的合成。此法有一定療效，但不良反應(yīng)較大，復(fù)發(fā)率高。

徐景藩教授認(rèn)為，炎癥性腸病的主要病因病機(jī)為“熱毒”。濕熱蘊結(jié)腸腑，久而化火釀毒，阻滯氣血，不通則痛；熱毒壅盛，肉腐成膿，內(nèi)潰成瘍；入營動血，迫血妄行，下痢膿血。在辨證論治的基礎(chǔ)上，徐老多選用蚤休、鴨跖草、紫草清熱涼血解毒，青蒿、地錦草清熱利濕，露蜂房攻毒止痛，白芷燥濕排膿，諸藥共奏清熱解毒、利濕斂瘍之效。

TNBS誘導(dǎo)以免疫介導(dǎo)的腸道炎癥模型，引起的免疫應(yīng)答以Th1為主，病變特點與炎癥性腸病類似[6]。本研究采用TNBS誘導(dǎo)小鼠IBD模型，動物存活率70%，可滿足研究需要。模型小鼠結(jié)腸重量/長度的比值、疾病活動指數(shù)以及病理評分均升高，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），表明TNBS誘導(dǎo)的IBD模型較好地體現(xiàn)了IBD從急性炎癥向慢性炎癥轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程，適用于IBD中藥復(fù)方的藥效學(xué)評價。與模型組相比，蚤休復(fù)方組小鼠存活率增高，IBD疾病活動指數(shù)明顯降低，結(jié)腸重量/長度比值降低，結(jié)腸病理評分明顯降低，小鼠結(jié)直腸炎癥水腫改善，結(jié)腸組織炎癥和隱窩損害明顯減輕降低。上述結(jié)果共同提示蚤休復(fù)方提取物能減輕TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病癥狀，具有較好的治療作用。

免疫因素，尤其是腸道免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異常，是IBD非常重要的發(fā)病原因及機(jī)制之一，細(xì)胞因子在機(jī)體免疫應(yīng)答中具有重要作用。本研究檢測了小鼠多種主要細(xì)胞因子含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，蚤休復(fù)方組小鼠CCR5配體MIP-1ɑ明顯減少（P=0.045），而 CXCR3 配體 CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）的血清水平顯著增加（P=0.006，P=0.027）。有研究表明，MIP-1ɑ增加會加重BALB/c實驗小鼠的結(jié)腸炎，其會顯著增加小鼠發(fā)生穿透性潰瘍的風(fēng)險[7]。Toll樣受體（TLR）與炎癥性腸病密切相關(guān)，特別是TLR3和TLR4。TLR一旦識別并結(jié)合PAMP（病原相關(guān)分子模式，如LPS）就會導(dǎo)致下游信號事件和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)激活，從而誘導(dǎo)抗微生物、化學(xué)趨化因子、細(xì)胞因子和共刺激因子的表達(dá)。TLR4與干擾素協(xié)同，調(diào)節(jié)趨化因子的生成，如MIG[8]。通過與其受體CXCR3結(jié)合，MIG吸引CD4+和CD8+T細(xì)胞，并激發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)。有研究提出，激活TLR通路可緩解炎癥性腸病小鼠腸道炎癥[9]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，靜脈應(yīng)用TLR配體既可呈現(xiàn)促炎作用，也可呈現(xiàn)抗炎作用，這取決于何種配體處于優(yōu)勢水平[10]。TLR4激動劑可刺激大量產(chǎn)生IP-10。IP-10是不同細(xì)胞對IFN-γ、微生物成分應(yīng)答后產(chǎn)生的CXC化學(xué)激活因子，可對單核細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)吸附作用，更重要的是Th1型細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)IP-10受體CXCR3[11]。TLR4的活化促進(jìn)炎癥前介質(zhì)的釋放，有助于白細(xì)胞的遷移浸潤，激活天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)組織纖維化[12]。本項研究結(jié)果提示，蚤休復(fù)方中單體成分可能與IFN-γ協(xié)同刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）等因子，進(jìn)而影響 T 細(xì)胞活化、趨化，具有類TLR4激動劑作用。蚤休復(fù)方調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的具體分子機(jī)制及活性單體成分有待進(jìn)一步研究。

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