血漿EBV-DNA在中晚期鼻咽癌患者中表達(dá)水平差異性

李中文 湯明 鄒彥

大量文獻(xiàn)證實(shí)EBV與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)。且同時表明血漿EBV-DNA水平和鼻咽的腫瘤負(fù)荷、預(yù)后、腫瘤治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況密切相關(guān)[1-2]。同時，有文獻(xiàn)報(bào)道血漿EBV-DNA水平在早期和中晚期鼻咽癌患者中存在差異性[3-4]。由于鼻咽癌發(fā)生部位隱蔽，癥狀不明顯，因此中晚期患者居多，作為鼻咽癌診斷和預(yù)后敏感性和特異性均較高的血漿EBV-DNA水平是否在初診中晚期鼻咽癌中存在較大差異，缺少相關(guān)資料。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技來分析60例中晚期初診鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平在中晚期不同分期的變化情況，進(jìn)一步證實(shí)血漿EBV-DNA水平在不同分期中晚期鼻咽癌診斷中的價值，為以后通過分析血漿EBV-DNA水平來早期判斷患者預(yù)后，以及為進(jìn)一步中晚期鼻咽的治療包括誘導(dǎo)化療、放療、同期化療等方案的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年12月-2013年5月，遵義醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院收治的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期鼻咽癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：鼻咽組織活檢病理證實(shí)為鼻咽非角化型或者角化型鱗狀細(xì)胞癌，且根據(jù)UICC第7版2010分期的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc期鼻咽癌患者。

1.2 方法 標(biāo)本采集采集血液標(biāo)本時間為鼻咽組織活檢病理證實(shí)為鼻咽非角化型或者角化型鱗狀細(xì)胞癌后1周內(nèi)，放化療開始前。熒光定量PCR引物及探針的設(shè)計(jì)血液標(biāo)本離心分離血漿，熒光定量PCR原理，參考文獻(xiàn)[5-6]。本院實(shí)驗(yàn)室德國羅氏公司產(chǎn)定量PCR系統(tǒng)，型號：Light Cycle。PCR反應(yīng)試劑盒來自中山醫(yī)科大學(xué)下屬達(dá)安基因診斷中心。上下游引物序列分別為 W-44F（5’-TCTATGACTACAGGCAA-3’）和 W-119R（5’-AGACGGCCTGTCCAACGT-3’）。在PCR反應(yīng)體系中加入雙標(biāo)記的熒光探針，探針序列 為：5’（FAM）CACTATATCTACAGTCCAGCCTCC（TAMRA）-3’。擴(kuò)增的目的基因是EBV的BamH1-W相關(guān)片段。

1.3 反應(yīng)體系 抽取外周血2 mL，3000 rpm，離心2 min，取白細(xì)胞層及血漿1000 μL，13 000 rpm，離心5 min，收集沉淀，純水洗滌3次。上清液2 μL，8000 rpm 8 s。PCR 循環(huán)條件：（1）93 ℃ 2 min；（2）93 ℃45 s→ 55 ℃ 60 s→ 10 循環(huán)；（3）93 ℃ 30 s→ 55 ℃45 s→30循環(huán)。

1.4 血漿游離EBV-DNA含量的計(jì)算 計(jì)算公式為C=Q×（VDNA/VPCR）×（1/Vext），其中C為血漿DNA拷貝數(shù)值（copies/mL），Q為經(jīng)PCR擴(kuò)增后計(jì)算機(jī)檢測的原始拷貝數(shù)值，VPCR是用于PCR擴(kuò)增的DNA的體積，VDNA為提取的DNA稀釋液體積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行結(jié)果分析，EBV-DNA拷貝數(shù)及年齡經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，不滿足正態(tài)分布者用中位數(shù)及四分位間距表示，組間差異采用秩和檢驗(yàn)，有差異者進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較；滿足正態(tài)分布者用（±s）表示，組間差異比較采用方差分析；組間性別比比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況 共納入患者60例，其中男54例，年齡28~75歲，中位年齡53.6歲；女6例，年齡31~68歲，中位年齡48.5歲。分期患者年齡、性別結(jié)構(gòu)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。本研究納入的鼻咽癌患者EBV-DNA檢出率為100%。

表1 各分期患者年齡與性別組成情況比較

2.2 患者血漿EBV-DNA定量PCR檢測結(jié)果比較 患者血漿EBV-DNA定量PCR檢測結(jié)果，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同分期鼻咽癌患者EBV-DNA拷貝數(shù)比較 ×103 copies/mL

3 討論

鼻咽癌雖然世界許多國家均有發(fā)生，但是大部分地區(qū)發(fā)病率較低。有明顯的區(qū)域性和種族聚集性，亞洲人多見，其中以中國的南方如廣東、廣西、湖南等地區(qū)最高。自O(shè)LD發(fā)現(xiàn)EBV（Epstein-Barr virus，EBV）與鼻咽癌在血清上有一定的關(guān)系以來，鼻咽癌患者EBV及其抗體的研究層出不窮。鼻咽癌的相關(guān)抗體主要是IgA、IgG、IgM，不能客觀、及時、準(zhǔn)確的反映病毒的感染情況和復(fù)制情況。即使患者腫瘤完全消失，達(dá)到治愈標(biāo)準(zhǔn)，其體內(nèi)的相關(guān)抗體消失也有明顯的滯后性，甚至部分患者持續(xù)存在[7]。

鼻咽癌病理表現(xiàn)非角化型或者角化型鱗狀細(xì)胞癌占90%以上。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)EBV-DNA是一個可靠、靈敏的指標(biāo)[8-11]。EBV和鼻咽癌的關(guān)系密切，基本上所有的非角化型或者角化型癌都能檢測到EBV-DNA。對于外周血漿的EBV-DNA的檢測方法有很多。其中主要的方法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的相關(guān)方法，包括PCR的定性、半定量和定量。特別是定量在靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性方面都有很高的價值，也是目前檢測血漿EBV-DNA最常用的方法。各種外周血漿EBV-DNA的PCR定量檢測不是檢測病毒的完整顆粒，而是對病毒DNA相關(guān)片段的檢測。大量研究發(fā)現(xiàn)，EBV的EBNA-1、EBNA-2、Bam HI-w結(jié)構(gòu)區(qū)域、BXLF-1基因片段是常用的檢測目標(biāo)片段，可以得到相似的陽性結(jié)果[12-14]。同時，不同基因片段間也存在一定的差異性。這其中BamHI-w結(jié)構(gòu)區(qū)域的研究最多，檢測這一片段可以大大的提高檢測的特異度和靈敏度，是臨床上最常用的目的基因片段。其本身為EBV的一段高度保守、高度重復(fù)的堿基序列。個體感染的EBV病毒株的亞型不完全一樣，堿基重復(fù)的次數(shù)也存在差異，一般在10~13次間。

有研究者應(yīng)用RT-PCR方法對80例鼻咽癌患者和80例感染過EBV的健康人群比較鼻咽癌患者外周血漿EBV-DNA陽性率達(dá)到90%，而80名感染過EBV的健康對照者外周血漿中并未檢出相關(guān)病毒。這重要發(fā)現(xiàn)表明EBV-DNA來自于感染EBV的腫瘤細(xì)胞的凋亡，而不是在血中復(fù)制的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞的凋亡值和血漿EBV-DNA呈現(xiàn)獨(dú)立的正相關(guān)性（P<0.05）[5]。也有人對100例鼻咽癌患者的外周血漿和原發(fā)部位的EBV的基因差異性進(jìn)行比較和PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果證實(shí)完全吻合。這一發(fā)現(xiàn)同樣也證實(shí)外周血EBV-DNA及其片段來自于原發(fā)部位腫瘤的凋亡[15]。大多數(shù)研究者認(rèn)為，EBV-DNA不是病毒感染后在外周血中的自我復(fù)制和分離，而是腫瘤生長部位的瘤細(xì)胞含有病毒顆粒，瘤細(xì)胞凋亡后病毒顆粒及其片段被釋放入血[5，13-16]。這一結(jié)論對于EBV-DNA在鼻咽癌診斷、分期、預(yù)后預(yù)測等的價值有著重要作用。因此，普遍認(rèn)為外周血漿EBV-DNA的水平與原發(fā)部位含有EBV的腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)有正相關(guān)性。同時，在細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞本身的脫氧核苷酸酶使病毒顆粒斷裂為80~190 bp間的小片段；而與宏觀的腫瘤侵犯周圍的血管床沒有明顯相關(guān)性。但是就EBV-DNA進(jìn)入外周血中的具體機(jī)制問題，目前還存在很多疑點(diǎn)。對于病毒在外周血中的代謝機(jī)制及其轉(zhuǎn)歸情況，目前沒有這方面的資料研究。所以，有學(xué)者推測其釋放入血機(jī)制很可能與細(xì)胞凋亡水解密切相關(guān)。對于鼻咽癌腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究，將有助于病毒代謝的研究。當(dāng)然對于外周血中EBV-DNA的研究，也有助于原發(fā)腫瘤的診斷、復(fù)發(fā)的判斷等。

總之，外周血漿中EBV-DNA對于鼻咽癌的敏感性和特異性均較高[7-8]。熒光定量PCR技術(shù)不僅具有PCR的高靈敏度特點(diǎn)，同時還具有準(zhǔn)確、快速、不容易被污染的特點(diǎn)[4]。為研究血漿EBV-DNA水平提供了可靠、安全、穩(wěn)定的方法。相關(guān)文獻(xiàn)資料表明血漿EBV-DNA水平相對穩(wěn)定，敏感性和特異性均較高。本組的EBV-DNA敏感性為100%。并且大量文獻(xiàn)證實(shí)EBV-DNA水平和鼻咽的腫瘤負(fù)荷，臨床分期，預(yù)后，腫瘤治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。EBV-DNA復(fù)制量隨著腫瘤負(fù)荷的增加，病情的加重而逐漸增加。但是在不同分期中，特別是中晚期鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平是否有差異，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對60例鼻咽癌初治患者在治療前血漿EBV-DNA水平進(jìn)行定量檢測。數(shù)據(jù)表明治療前Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期，EBV-DNA拷貝數(shù)中位數(shù)和范圍存在著明顯差異性。這一結(jié)果證實(shí)患者EBV-DNA水平在中晚期不同分期鼻咽癌患者外周血漿中存在明顯差異。從EBV-DNA水平的角度印證了血漿EBV-DNA在鼻咽癌診斷、分期中的價值和地位以及與各期預(yù)后情況相一致，以及和腫瘤負(fù)荷的相關(guān)關(guān)系。關(guān)于本組60例初治中晚期鼻咽癌患者，其血漿EBV-DNA均陽性，陽性率達(dá)到100%，這可能和樣本量不大有關(guān)。當(dāng)然，也和相關(guān)報(bào)道，中晚期鼻咽癌患者外周血血漿EBV-DNA陽性率在90%以上相符合。

需要指出的是，因?yàn)槟康臄U(kuò)增片段、PCR循環(huán)數(shù)、實(shí)驗(yàn)試劑、探針的大小、具體堿基序列等因素有很大的關(guān)系，各個實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)之間有一定的差異性，但是就單一一個實(shí)驗(yàn)室而言，自身具有客觀的可比性。但各研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理念、PCR的試劑和實(shí)驗(yàn)方法、儀器設(shè)備等不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)之間存在一定的差異[17]。這樣不利于數(shù)據(jù)之間的比較，分析等。其影響因素主要有兩個方面：（1）存在于外周血漿的游離EBV-DNA的片段大小多在80~190 bp之間。所以，擴(kuò)增PCR的目的片段也在190 bp以內(nèi)。但是擴(kuò)增片段的具體大小存在一定的差異。其結(jié)果也會有一定的差異。（2）定量PCR過程中PCR循環(huán)次數(shù)、引物和探針的片段序列及大小，目的基因的堿基序列等設(shè)計(jì)不同，對應(yīng)的檢出率和檢測結(jié)果必定存在一定的差異性[14]。因此，有學(xué)者呼吁建立統(tǒng)一的實(shí)時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品和統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)室條件，并制定出國際、國內(nèi)通用的標(biāo)準(zhǔn)，以便各個實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果有可比性和統(tǒng)一性。最終使血漿EBV-DNA成為一個廣泛應(yīng)用的血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)的。這對于現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較，以后實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，都有很大的益處。

總之，中晚期鼻咽癌患者不同分期外周血血漿EBV-DNA水平存在明顯差異性，這一結(jié)論對于將外周血血漿EBV-DNA作為鼻咽癌早期診斷、分期和預(yù)后判斷都有一定價值，對于是否不同分期鼻咽癌患者外周血漿EBV-DNA水平是否有恒定的數(shù)值范圍，還需要實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件的統(tǒng)一和大樣本的研究證實(shí)。

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