MMP-2、MMP-9在口腔黏膜白斑中表達(dá)的研究*

蘇穎穎 杜啟濤 張茜 曲哲

白斑屬于癌前病變，已有報道其進(jìn)展為鱗狀細(xì)胞癌與上皮異常增生的嚴(yán)重程度有直接的關(guān)系[1]，但目前還沒有一個明確的生物學(xué)指標(biāo)來評估這一惡變[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一種Zn2+依賴性的中性蛋白水解酶，可降解和塑造細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），維持細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，參與惡性腫瘤的發(fā)生及侵襲過程[3-4]。目前MMP在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究多有報道，而在白斑及上皮不同增生程度間表達(dá)的研究較少。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測MMP-2、MMP-9在正?？谇火つ?、白斑上皮單純性增生和異常增生中的表達(dá)情況，以期對兩者在白斑發(fā)生發(fā)展中的變化做初步的研究。

1 材料與方法

1.1 病例來源及選擇標(biāo)準(zhǔn) 本實驗選取的標(biāo)本均為2008-2014年間大連市口腔醫(yī)院頜面外科的手術(shù)標(biāo)本，所有患者均知情同意。其中正常組15例為黏液囊腫活檢標(biāo)本中的正?？谇簧掀そM織。由2位高年資病理醫(yī)生重新復(fù)核切片將白斑分為兩組：白斑上皮單純增生組31例和白斑上皮異常增生組35例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，取材后脫水制成石蠟，常規(guī)HE染色。實驗均設(shè)陽性對照和陰性對照，血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽性表達(dá)可作為內(nèi)對照參考[2]。

1.2 臨床病理特征 白斑上皮單純性增生31例，其中男19例，女12例，白斑上皮異常增生35例，其中男18例，女17例，見表1。

表1 白斑上皮單純性增生和白斑上皮異常增生的發(fā)生部位

1.3 主要試劑及方法 兔抗人MMP-2多克隆抗體（即用型），兔抗人MMP-9單克隆抗體（1：100），均由北京中杉金橋公司購得。采用免疫組化SP染色法。

1.4 結(jié)果判定 MMP-2和MMP-9均以胞漿呈棕褐色為陽性。根據(jù)綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行評價[5]：由兩人雙盲法觀察切片，染色陰性0分，染色弱1分，染色清晰2分，染色強(qiáng)3分；陽性細(xì)胞數(shù)<5%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)5%~25%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)26%~50%為3分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為4分。兩項之和≥4為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 MMP-2和MMP-9的免疫組化結(jié)果和各自病理間的關(guān)系應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2陽性表達(dá)在上皮細(xì)胞的胞漿中，主要分布于基底細(xì)胞層中，也可見棘細(xì)胞層中。三組陽性率表達(dá)情況見表2，三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。此外，在上皮下結(jié)締組織中也發(fā)現(xiàn)了MMP-2的表達(dá)，以成纖維細(xì)胞表達(dá)居多，也可見炎細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，成纖維細(xì)胞的陽性表達(dá)率見表3，三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 MMP-9陽性表達(dá)位于上皮細(xì)胞的胞漿中，多見于棘細(xì)胞層中。三組的陽性表達(dá)率見表4，其中白斑異常增生組較正常組和單純增生組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在上皮下結(jié)締組織中也發(fā)現(xiàn)了MMP-9的陽性表達(dá)，以聚集在成纖維細(xì)胞、炎細(xì)胞、血管周圍表達(dá)居多。成纖維細(xì)胞的陽性表達(dá)見表5，其中異常增生組的陽性率較正常組及單純增生組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表2 MMP-2在上皮內(nèi)表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果

表3 MMP-2在上皮下表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果

表4 MMP-9上皮內(nèi)免疫組化染色結(jié)果

表5 MMP-9上皮下免疫組化染色結(jié)果

3 討論

口腔癌的發(fā)病機(jī)理是一個多步驟、多因素的過程，其中包括從正?？谇火つさ絾渭冊錾?、異常增生、原位癌最后發(fā)展成浸潤癌的一個連續(xù)的病理過程[6]。白斑是口腔黏膜癌前病變中的一種，癌前病變是指轉(zhuǎn)變?yōu)轺[狀細(xì)胞癌的可能性增加的發(fā)生改變的上皮，這種上皮異常增生的程度越重，后期發(fā)展成癌的可能性就越大[7]。因此，有學(xué)者將無異常增生、可疑異常增生和輕度異常增生歸為低危險性；將中、重度異常增生和原位癌歸為高危險性[8]。

MMP-2、9是MMPs中重要的蛋白水解酶，主要降解Ⅳ型膠原蛋白。MMP-2基因位于人類染色體16q21，由12個內(nèi)含子和13個外顯子組成，結(jié)構(gòu)基因總長度為27 kb，分子量為72 KD，MMP-2可由體內(nèi)多種細(xì)胞合成和分泌，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、漿細(xì)胞、星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等[9]。MMP-9基因定位于20號染色體，分子量為92 KD，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌[10-11]。MMP-2、9在正常組織表達(dá)較少，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加[12]，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，并與基底膜中IV型膠原的喪失有關(guān)，在細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[13]。有研究顯示MMP-2、9可由EMMPRIN（細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子）調(diào)控，它可在腫瘤表面刺激鄰近成纖維細(xì)胞合成MMPs[14]。實驗結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞與上皮下成纖維細(xì)胞均有MMP-2、9的陽性表達(dá)，從正常黏膜到異常增生，陽性表達(dá)率增加。這與以往研究結(jié)果相似[15-16]。推測，隨著上皮異常增生的程度增加，上皮內(nèi)和上皮下的MMP分泌增加，共同作用于基底膜，使基底膜的連續(xù)性及完整性逐步降低，細(xì)胞的侵襲能力增加，形成惡性腫瘤的危險性增加。但本研究中MMP-2的陽性率在三組間無顯著差異可能與樣本量不足，或使用MMP-2多克隆抗體有關(guān)。MMP-9在上皮內(nèi)和上皮下成纖維細(xì)胞中的陽性率在異常增生組中明顯高于正常組和單純增生組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），推測其參與了白斑的發(fā)生發(fā)展過程。但因白斑終究為基底層上皮內(nèi)細(xì)胞學(xué)及結(jié)構(gòu)的改變，且尚未突破基底膜，有實驗研究不論是MMP或是基底膜中的IV型膠原在白斑中僅有量變的過程，尚未達(dá)到質(zhì)變，當(dāng)發(fā)展成鱗癌時兩者才發(fā)生了較明顯的變化[13]。此外，本實驗數(shù)據(jù)顯示，正常口腔黏膜與單純增生組的陽性率差異不大，猜測單純增生可能僅僅是因為吸煙或摩擦引起的上皮增生，去除病因有可能減輕病變。進(jìn)一步研究還需擴(kuò)大樣本量，并增加對原位癌及鱗癌的觀察及基因?qū)W的檢測。

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