裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對人肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制作用*

張文雋，吳亞召，雷 萍**，謝艷華，杜 芳

（1．陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2．第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032）

裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對人肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制作用*

張文雋1，吳亞召1，雷 萍1**，謝艷華2，杜 芳1

（1．陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2．第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032）

研究了裂蹄針層孔菌（Phellinus linteus）發(fā)酵菌絲體對人肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制作用。采用MTT比色法測定不同濃度發(fā)酵菌絲體對肝癌細(xì)胞存活率的影響；建立荷瘤HepG-2裸鼠模型，檢測不同劑量裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對腫瘤的抑制作用。MTT法觀察結(jié)果顯示，裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體可抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量（960 mg·L-1）能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，最佳抑制時(shí)間為24 h；裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體中劑量（500 mg/kg·d）、高劑量（1 000 mg/kg·d）對荷瘤HepG-2裸鼠有顯著的抑瘤作用，抑瘤率分別為40．42%、35．06%。裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對人肝癌HepG-2腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用。

裂蹄針層孔菌；發(fā)酵菌絲體；肝癌HepG-2；抑瘤作用

裂蹄針層孔菌（Phellinus linteus），又名裂蹄木層孔菌、針裂蹄、裂蹄木層孔，俗稱桑黃，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目 （Aphyllophorales） 銹革孔菌科 （Hymenochaeyaceae） 針層孔菌屬（Phellinus）[1]?！侗静菥V目》中有記載桑黃能“利五臟、宣腸胃氣、排毒氣”[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分復(fù)雜，含有多糖、黃酮、甾醇類、落葉松蕈酸等活性成分，具有顯著的抑制腫瘤以及提高機(jī)體免疫能力的作用[3-4]，已經(jīng)成為藥用真菌抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。

肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌，居我國癌癥患者死亡的第二位。最近的研究揭示裂蹄針層孔菌和現(xiàn)有化療藥物共同作用時(shí)，具有增強(qiáng)化療藥物藥效的作用[5]，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，也有一些文獻(xiàn)報(bào)道裂蹄針層孔菌菌絲體有一定抑瘤作用，且菌絲體可通過發(fā)酵工程大規(guī)模生產(chǎn)，克服子實(shí)體資源匱乏的缺點(diǎn)。本次試驗(yàn)通過研究裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對人肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制作用，以期為該真菌治療肝癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與細(xì)胞株

裸鼠40只，雌雄各半，4周～5周，體重在18 g～22 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

人肝癌HepG-2細(xì)胞株，由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所細(xì)胞室提供。

1.2 試驗(yàn)藥物

裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體：陜西省微生物研究所第三研究室，批號20130102。

順鉑：南京制藥公司，批號20120204。

1.3 主要儀器與試劑

SW-CJ-1F醫(yī)用型潔凈工作臺，蘇州惠豐凈化設(shè)備有限公司；Thermo Scientific 8000型CO2培養(yǎng)箱，Thermo Fisher公司；Coic生物顯微鏡，南京冀飛科技有限公司；L420臺式低速自動平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DHG-9701A型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高壓滅菌箱，北京勤誠盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司；微量進(jìn)樣器，Bio-Rad公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板，西安舟鼎國公司；Hy-Clone改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；雙抗：青霉素及鏈霉素溶液，北京索萊寶科技有限公司；噻唑蘭，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；二甲基亞砜（DMSO），北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇，天津天力化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水，晨欣制藥有限公司。

1.4 方法

1．4．1 細(xì)胞培養(yǎng)

取肝癌細(xì)胞HepG-2接種于改良型RPMI-1640（含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U·mL-1）培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1．4．2 MTT法檢測裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響

將細(xì)胞鋪于96孔板中，每組鋪3個板。裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體濃度設(shè)置為960 mg·L-1、480 mg·L-1、240 mg·L-1、120 mg·L-1、60 mg·L-1、30 mg·L-1、順鉑陽性對照組（DDP） 和空白陰性組（blank group）；加MTT以及DMSO分別測12 h、24 h、48 h細(xì)胞存活率，得出每個濃度及陽性對照組的抑制率，根據(jù)抑制率判斷藥物的抑制作用。抑制率為正值則說明藥物有作用，反之則無效。再分析各濃度的抑制率，得出裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體的最佳抑制濃度，確定該細(xì)胞的敏感濃度及時(shí)間[6]。抑制率（P）計(jì)算公式為：

式中：OD實(shí)驗(yàn)表示實(shí)驗(yàn)組OD值；OD空白表示空白組OD值。

1．4．3 裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對荷瘤裸鼠腫瘤生長抑瘤試驗(yàn)

（1）荷瘤HepG-2裸鼠模型的建立

取裸鼠40只，在其腹部皮下接種瘤細(xì)胞液0．2 mL（細(xì)胞濃度為1×104個·L-1），注射局部出現(xiàn)明顯皮丘疹，飼養(yǎng)于IVC動物凈化裝置內(nèi)。

（2）分組

觀察接種裸鼠接種部位腫瘤長出情況，待結(jié)節(jié)出現(xiàn)，進(jìn)行分組，每組樣本數(shù)為8。設(shè)置模型組（Model）、陽性對照組（DDP組，順鉑，3 mg/kg·d）、給藥組共三大類。其中，給藥組又分高劑量組（SHJⅢ，1 000 mg/kg·d）、中劑量組 （SHJII，500 mg/kg·d）、低劑量組（SHJI，250 mg/kg·d）。

高、中、低劑量組樣品均溶于生理鹽水后，進(jìn)行灌胃給藥（裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體）；陽性對照組溶于等體積生理鹽水同時(shí)腹腔給藥；模型組給予等體積生理鹽水并進(jìn)行灌胃給藥[7]。

（3）組織處理

連續(xù)給藥7 d，次日處死。無菌環(huán)境下取腫瘤組織，去血污稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（I）計(jì)算公式為：

式中：M1表示對照組平均瘤重；M2表示試驗(yàn)組平均瘤重。

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS12．0統(tǒng)計(jì)軟件以t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法測定其OD值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1，其中吸光度越小表示活細(xì)胞越少。

由表1可見，隨著濃度的增加，裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體表現(xiàn)出對肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的抑制作用（P＜0．05），且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量（960 mg·L-1）能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

由MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果所測OD值計(jì)算抑制率（IR），結(jié)果如圖1所示。

圖1 裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制作用Fig．1 Inhibition effect of Phellinus linteus mycelium on the liver cancer HepG-2

圖1中抑制率（IR）為正值時(shí)說明藥物有作用，反之則無效。從圖1可以看出，當(dāng)藥物濃度為960 mg·L-1作用24 h時(shí)，抑制率最大，即對肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制率最高。因此裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對肝癌HepG-2細(xì)胞的最佳抑制時(shí)間是24 h。

2.2 蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對荷瘤HepG-2裸鼠腫瘤生長抑瘤試驗(yàn)

蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對荷瘤HepG-2裸鼠腫瘤生長的影響見表2。

從表2可以看出，裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對荷瘤HepG-2裸鼠腫瘤生長有一定的抑制作用，給藥組的平均瘤重明顯小于對照組，3個劑量組的抑瘤率分別為15．24%、40．42%、35．06%，中劑量（500 mg/kg·d）抑瘤效果最好。

表2 蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對荷HepG-2瘤裸小鼠腫瘤生長的影響（n=8）Tab．2 Effect of Phellinus linteus mycelium on the growth of HepG-2 tumor(n=8)

3 小結(jié)

在本試驗(yàn)條件下，采用MTT法觀察結(jié)果顯示，濃度在480 mg·L-1～960 mg·L-1范圍內(nèi)，裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體可抑制肝癌HepG-2細(xì)胞生長的增殖，且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，高劑量（960 mg·L-1）能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，最佳抑制時(shí)間為24 h；通過建立荷瘤HepG-2裸鼠模型，不同劑量裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對腫瘤的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果表明，其高劑量（1 000 mg·kg-1）、中劑量（500 mg·kg-1） 對荷瘤HepG-2裸鼠有顯著的抑瘤作用，抑瘤率分別為40．42%、35．06%。體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示，裂蹄針層孔菌發(fā)酵菌絲體對人肝癌HepG-2細(xì)胞有較好的抗腫瘤作用。

[1]張小青，戴玉成．中國真菌志[M]．北京：科學(xué)出版社，2005：117-191．

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[4]劉云，胡珊珊，朱欣婷，等．裂蹄木層孔菌醋酸乙酯萃取物抗腫瘤活性初探[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23（9）：2234-2236．

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Inhibition Effect on the Liver Cancer Cell(HepG-2)of Fermentation Mycelium of Phellinus linteus

ZHANG Wen-jun1,WU Ya-zhao1,LEI Ping1,XIE Yan-hua2,DU Fang1
(1．Shaanxi Microbioogy Research Institute,Xi’an 710043,China;2．The Fourth Medical University,Xi’an 710032,China)

The inhibition effect on HepG-2 of Phellinus linteus mycelium was studied．The survival rates of cancer cell by different concentration mycelium using MTT method were determined,and through establish tumor bearing HepG-2 mice model, the inhibition effect of different dose mycelium on tumor was studied．The results demonstrated that mycelium could inhibit HepG-2 cell proliferation in a dose-dependently,high dose of 960 mg·L-1could significantly suppress cancer cell proliferation with the optimum time of 24 hours．The mycelium also have outstanding tumor suppression on tumor bearing HepG-2 mice,with inhibitory rates of 40．42%and 35．06%at the respective doses of 500 mg/kg·d and 1000 mg/kg·d．The fermentation mycelium of P.linteus had stronger inhibition effect on HepG-2．

Phellinus linteus;fermentation mycelium;HepG-2;anti-tumor effect

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0060-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．015

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013JM3021）；陜西省科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)與產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（2012K-17、2014K-14）；西安市科技局技術(shù)轉(zhuǎn)移促進(jìn)工程（CXY1348（4））。

張文雋（1977-），女，碩士，助理研究員，主要從事食（藥）用真菌方面的研究。E-mail:zhwj2002199@sina．com

**通信作者：雷萍（1966-），女，副研究員，主要從事食（藥）用菌菌種選育、人工栽培及深加工產(chǎn)品的研究與開發(fā)。E-mail:wuleiping2529@126．com

2015-09-20