藥用真菌星裂硬皮馬勃的生藥學(xué)研究*

王大可，宮詩林，許利婷，周 賢，王淑敏**

（1．長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2．中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

藥用真菌星裂硬皮馬勃的生藥學(xué)研究*

王大可1，宮詩林2，許利婷1，周 賢1，王淑敏1**

（1．長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2．中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

對(duì)藥用真菌星裂硬皮馬勃進(jìn)行生藥學(xué)研究，為其開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。采集星裂硬皮馬勃子實(shí)體，通過性狀鑒別、菌絲和孢子顯微特征觀察，結(jié)合文獻(xiàn)資料鑒定種類。利用薄層色譜建立星裂硬皮馬勃專屬性薄層鑒別特征，利用高效液相色譜法測(cè)定其化學(xué)成分含量。經(jīng)過性狀及顯微特征觀察，確定為藥用真菌星裂硬皮馬勃（Scleroderma polyrhizum Pers．）。薄層鑒別研究發(fā)現(xiàn)具有多個(gè)專屬性的薄層色譜斑點(diǎn)，并含有麥角甾醇。高效液相色譜法測(cè)定其麥角甾醇含量為0．18%、甘露醇含量為0．50%。通過星裂硬皮馬勃性狀鑒別、掃描電鏡下菌絲和孢子特征觀察、薄層色譜鑒別，可綜合鑒別星裂硬皮馬勃的真?zhèn)危瑸槠滂b別提供了參考依據(jù)。麥角甾醇和甘露醇含量可作為其質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，也為今后星裂硬皮馬勃開發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

星裂硬皮馬勃；生藥學(xué)；麥角甾醇；甘露醇

星裂硬皮馬勃 （Scleroderma polyrhizum Pers．）是生長(zhǎng)在闊葉林帶中一種常見的食（藥） 用真菌，別名多根硬皮馬勃。屬于硬皮馬勃目（Sclerodermatales)硬皮馬勃科（Sclerodermataceae)硬皮馬勃屬（Scleroderma）。夏秋季林中地上單生，可與云杉、松、櫟形成外生菌根。幼時(shí)可食，味較好。子實(shí)體具有消腫、止血、解毒等功效，可用于治療消化道出血和外傷出血等。因此，研究星裂硬皮馬勃生藥學(xué)特征可為今后其食藥用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

XS-213型生物顯微鏡，石家莊顯微鏡艾迪科教設(shè)備有限公司；XL 30 FEG Scanning Electron Microscope，F(xiàn)EI公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；RID-10A示差折光檢測(cè)器。麥角甾醇、甘露醇對(duì)照品購于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，美國(guó)Fisher公司；水為超純水（18．2 ΩPa），其他試劑均為分析純。星裂硬皮馬勃采于吉林省德惠市朱城子鄉(xiāng)楊樹林下，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 星裂硬皮馬勃的鑒別

2．1．1 性狀鑒別

子實(shí)體類球形，直徑4 cm～12 cm。基部緊縮成一小的柄狀基部。包被淺黃色至淺土黃色，堅(jiān)硬，似革質(zhì)，干后厚約1 mm～2 mm，表面有龜裂紋或鱗片，成熟時(shí)星狀開裂，裂片反卷。孢體暗褐色，粉性，質(zhì)輕。生長(zhǎng)在林中樹下，外生菌根菌，可與楊、桉、馬尾松等樹形成菌根[1-2]（圖1～圖2）。

2．1．2 顯微鑒別

孢子球形，暗褐色，具短孢子柄，壁有凹陷窩，呈現(xiàn)不規(guī)則的網(wǎng)孔，直徑6．5 μm～12 μm[1-2]。掃描電鏡特征見圖3～圖4。

圖1 星裂硬皮馬勃子實(shí)體幼嫩期Fig．1 Tender period of Scleroderma polyrhizum sporophore

圖2 星裂硬皮馬勃子實(shí)體成熟期Fig．2 Maturation period of Scleroderma polyrhizum sporophore

圖3 星裂硬皮馬勃菌絲和孢子（×500）Fig．3 Spore and mycelium of Scleroderma polyrhizum(×500)

圖4 星裂硬皮馬勃孢子（×5 000）Fig．4 Spore of Scleroderma polyrhizum(×5 000)

2．1．3 薄層鑒別

取星裂硬皮馬勃孢子1 g，加二氯甲烷40 mL，回流提取1 h，過濾，濾液揮發(fā)干燥，殘?jiān)佣燃淄? mL使之溶解，作為供試品溶液。另取麥角甾醇對(duì)照品2 mg，加入2 mL二氯甲烷溶解，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，置以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸（7∶4∶0．3）為展開劑的展開缸內(nèi)飽和20 min，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，有如圖5所示的專屬性熒光斑點(diǎn)[3]。噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，并顯示如圖6所示的其它專屬性斑點(diǎn)。

圖5 星裂硬皮馬勃薄層色譜熒光圖（1、3為孢子，2、4為麥角甾醇）Fig．5 TLC fluorescent of Scleroderma polyrhizum(1，3：spore,2，4：ergosterol)

圖6 星裂硬皮馬勃薄層色譜圖（1、3為孢子，2、4為麥角甾醇）Fig．6 TLC of Scleroderma polyrhizum (1，3：spore，2，4：ergosterol)

2.2 星裂硬皮馬勃化學(xué)成分測(cè)定

2．2．1 麥角甾醇含量的測(cè)定

（1） 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取麥角甾醇對(duì)照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得（0．1 mg·mL-1）。

（2）供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取星裂硬皮馬勃孢子0．5 g，置干燥具塞的三角瓶中，加入10 mL甲醇，精密稱定重量，超聲提取1 h，放至室溫，稱重，補(bǔ)加甲醇至原重量，過濾，取濾液過0．45 μm濾膜，即得供試品溶液，備用。

（3）色譜條件

漢邦ODS-C18色譜柱（4．6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，流速1．0 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL[4-6]。理論塔板數(shù)以麥角甾醇峰計(jì)，不得少于3 000。色譜圖見圖7、圖8。

圖7 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig．7 HPLC of the ergosterol standard sample

圖8 星裂硬皮馬勃孢子HPLC圖Fig．8 HPLC of the Scleroderma polyrhizum spore

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密吸取對(duì)照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定吸收峰面積分別為：217 449、487 105、748 580、1 002 171、1 268 122、1 527 775、1 783 282。以麥角甾醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y=130 328X-37 700，r=1，麥角甾醇在0．2000 μg～1．4000 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（5）樣品中麥角甾醇含量測(cè)定

取供試品溶液，按2．2．2（3）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中麥角甾醇的含量，結(jié)果孢子中麥角甾醇含量為0.18%。

2.2.2 甘露醇含量的測(cè)定

（1）對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘露醇對(duì)照品3 mg，置于2 mL容量瓶中，加超純水溶解，定容，即得（1.565 mg·mL-1）。

（2）供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取星裂硬皮馬勃孢子0.1 g，加水5 mL，精密稱重，超聲提取30 min，放至室溫后稱重，加水補(bǔ)足減失重量，搖勻，2 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

（3）色譜條件

色譜柱為SUGAR SC1011柱（300 mm×8 mm，6 μm），流動(dòng)相為超純水，流速0.5 mL·min-1，柱溫70℃，進(jìn)樣量10 μL[7-8]。色譜圖見圖9、圖10。

圖9 甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.9 HPLC of the standard sample of mannitol

圖10 星裂硬皮馬勃孢子HPLC圖Fig.10 HPLC of the spore of Scleroderma polyrhizum

（4）甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密吸取對(duì)照品溶液 4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定吸收峰面積。峰面積分別為102 243、154 681、205 751、258 371、311 881。以甘露醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：Y=16 708X-2 601，r=0.9999，甘露醇在6.260 μg～18.780 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（5）樣品中甘露醇含量測(cè)定

取供試品溶液，按“2.2.2（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中甘露醇的含量，結(jié)果孢子中甘露醇含量為0.50%。

3 結(jié)論

通過星裂硬皮馬勃性狀鑒別、掃描電鏡下孢子和菌絲特征、薄層鑒別圖譜等方法，可綜合鑒別星裂硬皮馬勃的真?zhèn)?，為其鑒別提供參考依據(jù)。薄層鑒別研究表明，星裂硬皮馬勃含有麥角甾醇成分，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，其含量為0.18%。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性，與膜結(jié)合酶的活性，膜的流動(dòng)性，細(xì)胞活力及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?。麥角甾醇具有重要的生理作用，其為生產(chǎn)激素類藥物的中間體，可用來生產(chǎn)可的松，具有維生素D2的作用，可作為星裂硬皮馬勃質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

高效液相色譜測(cè)定甘露醇的含量為0.50%。甘露醇已經(jīng)應(yīng)用于治療顱內(nèi)疾病、頑固心絞痛、消化系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、眼科疾病、頑固性超高熱以及中毒時(shí)導(dǎo)瀉等疾病，顯示了甘露醇在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間[8]。星裂硬皮馬勃含有較高的甘露醇，提示其可能具有更廣泛的應(yīng)用，為今后的研究開發(fā)指明了方向，同時(shí)也可作為星裂硬皮馬勃質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

[1]卯曉嵐.中國(guó)大型真菌[M].鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000：543.

[2]周彤燊.中國(guó)真菌志[M].北京：科學(xué)出版社，2007：59.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[4]張方英，方保梅，張靜.靈芝制品中麥角甾醇的檢測(cè)方法[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997（19）：22.

[5]張麗，王瑜杰，丁安偉.HPLC法測(cè)定靈芝孢子油中麥角甾醇的含量[J].江蘇中醫(yī)藥，2009，41（6）：52-53.

[6]谷學(xué)新，趙紅帥，鄒洪，等.高效液相色譜法測(cè)定功能性紅曲米粉中的麥角甾醇[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2006（1）：78-79.

[7]田貞樂，徐春花.HPLC-RID法測(cè)定蟲草菌絲體中甘露醇[J].食用菌學(xué)報(bào)，2010（增刊）：113-115.

[8]蔡友華，范文霞，劉學(xué)銘，等.超聲-微波協(xié)同萃取巴西蟲草菌絲體中甘露醇的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：348-353.

Research on Pharmacognostics of Medicinal Fungi Scleroderma polyrhizum Pers.

WANG Da-ke1,GONG Shi-lin2,XU Li-ting1,ZHOU Xian1,WANG Shu-min1
(1．Pharmaceutical College of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Jilin 130117,China; 2．Pharmaceutical College of China Pharmaceutical University,College of Pharmacy,Nanjing 210009,China)

The pharmacognostics of medicinal fungi Scleroderma polyrhizum Pers．were studied,which provided a identifying basis for the development and application．The sporophore of S.polyrhizum was collected so that its species was identified by researching morphological of microscopic characteristics of spore and mycelium as well as literature．TLC was used to establish the specificity of S.polyrhizum,and its chemical composition content were determined by HPLC．The collected S.polyrhizum was identified as the medicinal fungi puffballs,after the study of characters and microscopic characteristics．A plurality of specific TLC spots were found in TLC study,including ergosterol．The ergosterol content were determined of 0．18%using HPLC method and the content of mannitol was 0．5%in S.polyrhizum．We can identify comprehensively the authenticity of S.polyrhizum through the identification of characters,observing the characteristics of spore and mycelium by optical microscope and scanning electron microscope and TLC atlas,it provided the referenced evidence for the identification of S.polyrhizum．The content of ergosterol and mannitol can be selected as an important indicator for quality control in S.polyrhizum,and provided scientific data for its development and utilization in the future．

Scleroderma polyrhizum Pers．;pharmacognostics;ergosterol;mannitol

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0050-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．013

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81274037）；吉林省教育廳項(xiàng)目 (吉教科合字 [2013]第85號(hào))。

王大可（1988-），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail:821751904@qq．com

**通信作者：王淑敏（1965-），女，博士，教授，主要從事中藥分析學(xué)及微生物與生化藥物方面研究。E-mail:446097156@qq．com

2015-09-07