糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971對(duì)靈芝多糖合成的影響

陳云,趙麗婷,顧正華,李由然,石貴陽(yáng),丁重陽(yáng)*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

靈芝(Ganodermalucidum)是隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)、靈芝菌科、靈芝屬[1]的食藥用真菌。靈芝中含有蛋白質(zhì)、多糖、三萜等活性物質(zhì),多糖是其最主要的活性物質(zhì)之一,具有抗腫瘤、抗氧化和降血糖[2]等作用,可用于食品[3-4]和醫(yī)療[5-7]等多個(gè)行業(yè)。

靈芝多糖的合成過(guò)程與細(xì)菌類似,可總結(jié)為核苷酸糖(糖供體)的合成,糖鏈的連接和多糖的胞外輸出(涉及胞外多糖)。多糖合成途徑中的酶種類豐富,已有研究證明了糖供體合成途徑中的酶對(duì)多糖合成的調(diào)控作用。例如,過(guò)表達(dá)磷酸葡萄糖變位酶[8],可使靈芝胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量分別提高9.1%和39.2%；此外,過(guò)表達(dá)半乳糖激酶和尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶[9],使蛹蟲(chóng)草多糖產(chǎn)量分別提高了28.57%和21.43%。然而,關(guān)于食藥用真菌中參與糖鏈連接的糖基轉(zhuǎn)移酶研究報(bào)道較少。糖基轉(zhuǎn)移酶是多糖合成中的關(guān)鍵酶,負(fù)責(zé)許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物的生物合成[10],可催化糖供體和受體以特定的鍵連接。國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌多糖合成中的糖基轉(zhuǎn)移酶的研究已較為成熟,細(xì)菌O-多糖生物合成的起始底物為GalNAc-PP-Und,李磊[11]經(jīng)化學(xué)合成該底物后,使用相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)了“RU-PP-Und”的順序合成。LAMOTHE等[12]研究發(fā)現(xiàn),德氏乳桿菌的epsE基因編碼一種磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,可啟動(dòng)胞外多糖的生物合成。這些也為食藥用真菌中糖鏈合成的研究提供了參考。

盡管靈芝多糖合成中糖供體的合成途徑已較為清晰,但對(duì)于靈芝多糖合成中另一個(gè)重要環(huán)節(jié)——糖鏈連接的認(rèn)識(shí)仍不清晰。本課題組通過(guò)對(duì)靈芝進(jìn)行全基因組序列注釋和全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析,挖掘得到了一系列參與糖鏈延伸的糖基轉(zhuǎn)移酶[13]。針對(duì)其中一個(gè)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971展開(kāi)了進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)其功能為以UDP-葡萄糖為供體,催化葡聚糖鏈延伸。因此本研究以GL24971為研究對(duì)象,初步探究它對(duì)靈芝多糖合成的影響。通過(guò)該研究可進(jìn)一步完善靈芝多糖的合成途徑,為針對(duì)大型真菌使用分子生物學(xué)手段提高多糖產(chǎn)量提供思路；同時(shí)也為探究靈芝多糖合成中其他的糖基轉(zhuǎn)移酶的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

靈芝菌株Ganodermalucidum5.26,中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC);大腸桿菌BL21(DE3)、克隆質(zhì)粒PMD19T(Simple)、質(zhì)粒pAN7-1、質(zhì)粒p1300-1，本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)中所用的gpdi啟動(dòng)子,Tsdh終止子均從靈芝基因組DNA克隆獲得。

靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：無(wú)氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids,YNB)5.0,蛋白胨5.0,KH2PO44.5,MgSO4·7H2O 2.0,葡萄糖20.0；

CYM培養(yǎng)基：麥芽糖10.0 g/L,蛋白胨2.0 g/L,酵母粉2.0 g/L,KH2PO44.6 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,葡萄糖20.0 g/L,甘露醇0.6 mol/L；

絲狀真菌通用培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0,酵母粉5.0,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 1.0,維生素B10.1,葡萄糖20.0。

1.1.2 主要試劑和儀器

YNB、潮霉素、維生素B1,上海源葉生物科技有限公司；Biospin 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(無(wú)DNA殘留型),杭州博日科技股份有限公司；ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit、HiScript?Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Nikon SMZ25顯微鏡,南京斯高譜儀器有限公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡,德國(guó)徠卡公司；qTOWER3G實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀,美國(guó)Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀,美國(guó)TECAN公司；GC-2030AF氣相色譜儀,日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝糖基轉(zhuǎn)移酶基因GL24971的擴(kuò)增

提取靈芝的RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以靈芝cDNA為模板,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增得到糖基轉(zhuǎn)移酶基因GL24971。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

為構(gòu)建潮霉素表達(dá)盒g(shù)pdi-hmb-Tsdh,從質(zhì)粒pAN7-1上克隆得到潮霉素抗性基因hmb,將啟動(dòng)子gpdi,潮霉素抗性表達(dá)框hmb及終止子Tsdh連接到質(zhì)粒PMD19T,獲得重組質(zhì)粒exp-Hmb。

為構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒g(shù)pdi-GL24971-eGFP-CaMV,從質(zhì)粒p1300-1上克隆獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白eGFP和終止子CaMV,將啟動(dòng)子gpdi,基因GL24971,eGFP及終止子CaMV連接到在EcoR V單克隆位點(diǎn)線性化的質(zhì)粒exp-Hmb,獲得重組質(zhì)粒exp-GL24971-eGFP。

從斜面培養(yǎng)基中接種靈芝到靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃,150 r/min條件下培養(yǎng)7 d后,轉(zhuǎn)接到新的靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中,25 ℃靜置培養(yǎng)4 d。

靈芝原生質(zhì)體的制備及其轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。靜置培養(yǎng)后的靈芝菌絲轉(zhuǎn)入滅菌的50 mL離心管,4 ℃,6 500 r/min離心5 min,去上清液；加適量無(wú)菌水和0.6 mol/L甘露醇洗滌菌體,離心去上清液,余少量液體分裝至提前稱重5 mL離心管,每管用0.6 mol/L甘露醇補(bǔ)足3 mL,室溫,10 000 r/min離心10 min后去上清液,稱濕菌體質(zhì)量,加入溶壁酶與蝸牛酶,振蕩打散,置于30 ℃,150 r/min酶解2.5 h后過(guò)濾,濾液分裝在1.5 mL離心管中,4 ℃,3 500 r/min離心10 min去上清液,加入1 mL預(yù)冷的無(wú)菌PTC緩沖液,重懸沉淀,離心去上清液,吸取適量PTC緩沖液補(bǔ)足200 μL,重懸沉淀,取10 μL原生質(zhì)體用于顯微鏡觀察,余下原生質(zhì)體加入PTC緩沖液補(bǔ)足200 μL。取未加待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的原生質(zhì)體涂至未添加潮霉素的CYM固體平板用于復(fù)生,剩余的原生質(zhì)體用于轉(zhuǎn)化：加入10 μg待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒,混勻,冰上靜置10 min；加入200 μL 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)緩沖液,混勻,冰上靜置10 min,重復(fù)1次；最后加入800 μL PEG緩沖液,混勻,30 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min。室溫,4 000 r/min離心10 min,去上清液,加入1 mL的CYM液體培養(yǎng)基,混勻,25 ℃后培養(yǎng)2 d后涂至含80 mg/mL潮霉素的CYM固體平板。

1.2.3 轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)化平板上菌落接種到新的絲狀真菌通用培養(yǎng)基固體平板上,拍照記錄其生長(zhǎng)狀況；挑取菌絲制片并使用激光共聚焦顯微鏡觀察菌絲中是否有綠色熒光。

將轉(zhuǎn)化菌株接種至靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中液體培養(yǎng),30 ℃,150 r/min培養(yǎng)14 d后,轉(zhuǎn)接至新的靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)5～8 d,發(fā)酵結(jié)束后離心獲得菌體,用去離子水沖洗3次后在真空冷凍干燥機(jī)中凍干,獲得干燥菌體,測(cè)定菌體干重作為其生物量,拍照記錄菌球形態(tài)。

1.2.4 相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析

將液態(tài)發(fā)酵7 d的新鮮菌體用去離子水沖洗3次,擠干菌球內(nèi)水分,根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取靈芝RNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5 胞內(nèi)外多糖測(cè)定及單糖組分分析

胞外多糖測(cè)定：參照苯酚-硫酸法[15]。通過(guò)離心分離菌絲體和發(fā)酵液,取1 mL發(fā)酵液,加入3 mL無(wú)水乙醇,混勻后4 ℃過(guò)夜,10 000 r/min離心5 min,去上清液,用75%乙醇洗滌沉淀,去上清液,晾干殘留乙醇,加入4 mL水復(fù)溶沉淀,10 000 r/min離心5 min,取2 mL上清液液作為待測(cè)樣品。

胞內(nèi)多糖測(cè)定：將凍干后的菌體研磨成粉末,稱取20～30 mg凍干的菌體粉末,加入4 mL水,沸水煮3 h后10 000 r/min離心5 min,取1 mL上清液液加入3 mL無(wú)水乙醇,后續(xù)同胞外多糖測(cè)定方法。

單糖組分分析參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。離心分離菌絲體和發(fā)酵液,取適量發(fā)酵液加入3倍體積無(wú)水乙醇,混勻后4 ℃過(guò)夜,離心去上清液,沉淀用75%乙醇洗滌3次后,加適量去離子水復(fù)溶,液體凍干后得到胞外粗多糖；稱取適量菌粉后加水煮沸3 h,離心后獲得上清液,加入3倍體積無(wú)水乙醇,后續(xù)操作同胞外粗多糖,最后獲得胞內(nèi)粗多糖。取適量?jī)龈傻亩嗵羌尤? mL 1 mol/L的硫酸,105 ℃水解8 h,冷卻后加BaCO3中和至中性,10 000 r/min離心10 min后取上清液,水洗沉淀2次,合并上清液,加1 mg肌醇作內(nèi)標(biāo),凍干后即為水解單糖；稱取凍干的水解單糖加20 mg/mL的溶于吡啶的鹽酸羥胺0.5 mL,90 ℃反應(yīng)30 min,冷卻后加0.5 mL乙酸酐,90 ℃反應(yīng)30 min,樣品冷卻后離心取上清液,送樣進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞壁組成成分測(cè)定

真菌細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)和β-葡聚糖[17],為分析過(guò)表達(dá)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971對(duì)細(xì)胞壁造成的影響,測(cè)定了這2種成分是否發(fā)生變化。

β-1,3-葡聚糖的測(cè)定參考苯胺藍(lán)熒光檢測(cè)法[18]。稱取40～50 mg凍干菌體,加2 mL 1 mol/L NaOH,52 ℃水浴30 min,10 000 r/min離心10 min,取0.5 mL上清液作為待測(cè)樣品,加入1.85 mL苯胺藍(lán)混合液,52 ℃水浴30 min,取樣品于405 nm、460 nm的條件下檢測(cè)其熒光值。β-1,3-葡聚糖含量表示為單位菌體的相對(duì)熒光百分比。

幾丁質(zhì)測(cè)定參考文獻(xiàn)[19-20]的方法。稱取40～50 mg凍干菌體,加入3 mL飽和KOH溶液,130 ℃反應(yīng)1 h,冷卻后加入預(yù)冷的75%乙醇8 mL,振蕩懸浮,冰浴15 min；加入0.9 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.3% 硅藻土 54 s,振蕩懸浮,4 ℃,10 000 r/min離心5 min；使用10 mL預(yù)冷的40%乙醇和去離子水沖洗沉淀,離心去上清液,加入30 mL去離子水,混合均勻,取0.5 mL作為待測(cè)樣品。將0.5 mL水、5% NaNO2、5% KH2PO4加入0.5 mL樣品中,混勻,10 000 r/min離心10 min,取0.5 mL樣品,加入0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%的氨基磺酸銨,振蕩5 min；加入0.5 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙鹽酸鹽水合物,混合后沸水加熱3 min；冷卻后加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.83%的FeCl3,室溫靜置30 min,檢測(cè)650 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以靈芝cDNA為模板,擴(kuò)增得到葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因GL24971,結(jié)果如圖1-a所示,基因片段GL24971的條帶位置與理論大小一致,為2 229 bp,圖1-b為重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒exp-GL24971-eGFP,可用于轉(zhuǎn)化至靈芝原生質(zhì)體。

a-GL24971基因擴(kuò)增結(jié)果；b-重組質(zhì)粒圖譜M-DNA Marker;1-GL24971圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至靈芝原生質(zhì)體

通過(guò)PEG轉(zhuǎn)化法,將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒exp-GL24971-eGFP轉(zhuǎn)化至靈芝原生質(zhì)體,以未轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的原生質(zhì)體為對(duì)照。原生質(zhì)體復(fù)生板和轉(zhuǎn)化板出現(xiàn)菌落(圖2-a),說(shuō)明原生質(zhì)體制備成功；在激光共聚焦顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)化菌株的菌絲體中有綠色熒光(圖2-b),說(shuō)明表達(dá)融合蛋白GL24971-eGFP的重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體,且融合蛋白成功表達(dá)并分布于胞質(zhì)。挑取30株重組菌,接種于含有潮霉素的絲狀真菌通用培養(yǎng)基固體平板上傳代,挑選能夠穩(wěn)定遺傳的菌株,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。

a-轉(zhuǎn)化菌株菌落狀態(tài):a1-原生質(zhì)體復(fù)生;a2-轉(zhuǎn)化板;b-熒光驗(yàn)證：b1-明場(chǎng);b2-熒光場(chǎng);b3-疊加場(chǎng)圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及融合蛋白表達(dá)Fig.2 Transformation of recombinant plasmid and expression of fusion protein

2.3 轉(zhuǎn)錄水平分析

將9株可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化菌株液態(tài)培養(yǎng)7 d后,收集新鮮樣品,提取靈芝RNA,以原始菌株為對(duì)照,測(cè)定葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖3所示,其中轉(zhuǎn)化菌株T1與T2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分別提高了124.5%與210.7%,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步針對(duì)這2株轉(zhuǎn)化子展開(kāi)研究。

圖3 轉(zhuǎn)化菌株相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.3 Analysis of relative transcription level注：不同的小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)化菌株T1與T2在平板培養(yǎng)后拍照記錄其生長(zhǎng)狀況。轉(zhuǎn)化菌株在無(wú)抗板上生長(zhǎng)較快,在含抗生素的平板上的生長(zhǎng)受到抑制。在含抗生素的平板中,T1與T2在培養(yǎng)到第7天時(shí),T2可以觀察到明顯的菌絲生長(zhǎng),而T1此時(shí)還未觀察到菌絲(圖4-a～4-d),可能是T2轉(zhuǎn)錄水平高于T1,使得抗性能更快更多的積累,導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)情況產(chǎn)生差異。

T1與T2液體發(fā)酵5～8 d后測(cè)定其生物量和菌球形態(tài)。由圖4-e可知,T1與T2的最大生物量分別為3.31與4.16 mg/mL,相比于原始菌株在第8天時(shí)的生物量6.65 mg/mL,分別降低了50.2%與37.5%。觀察菌球形態(tài)發(fā)現(xiàn),原始菌株菌球形態(tài)不規(guī)則,呈絮狀且較松散,表面粗糙,而T1與T2菌球緊實(shí),基本為球形且表面較光滑(圖4-f～4-h)。

a-T1(抗生素平板);b-T1(無(wú)抗平板);c-T2(抗生素平板);d-T2(無(wú)抗平板);e-菌株生物量;f-原始菌株形態(tài);g-轉(zhuǎn)化菌株T1形態(tài);h-轉(zhuǎn)化菌株T2形態(tài)圖4 轉(zhuǎn)化菌株生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of transformed strains

2.5 胞內(nèi)外多糖及單糖組分測(cè)定

轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵到第5天時(shí)開(kāi)始測(cè)定胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量。結(jié)果顯示,T1與T2的單位菌體胞外多糖最大產(chǎn)量分別為0.07與0.06 mg/mg(圖5-a),分別提高了132.4%與70.0%,胞內(nèi)多糖產(chǎn)量均為0.03 mg/mg,分別降低了10.7%與37.4%(圖5-b)。

a-胞外多糖;b-胞內(nèi)多糖圖5 多糖產(chǎn)量Fig.5 Production of polysaccharides

為分析過(guò)表達(dá)GL24971對(duì)多糖中單糖組分的影響,測(cè)定了胞內(nèi)外粗多糖的單糖組分。表1顯示,原始菌株的胞外多糖組分中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖,而T1與T2菌株的胞外多糖組分中葡萄糖的比例提高,且?guī)缀跷礄z測(cè)到半乳糖的存在。胞內(nèi)多糖單糖組成結(jié)果顯示(表2),在原始菌株和轉(zhuǎn)化菌株的胞內(nèi)多糖組分中均檢測(cè)到木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其中木糖所占比例較小,且轉(zhuǎn)化菌株中半乳糖含量明顯降低。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因GL24971的過(guò)表達(dá)使得大量UDP-葡萄糖被合成和利用,因此多糖中葡萄糖的比例得到提高。同時(shí),根據(jù)糖供體合成途徑可知,UDP-葡萄糖可在UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的作用下被轉(zhuǎn)化為UDP-半乳糖,由于UDP-葡萄糖被葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971大量消耗,使得其流向UDP-半乳糖合成的量減少,從而導(dǎo)致胞內(nèi)外多糖中半乳糖組分的比例出現(xiàn)下降。

表1 胞外多糖中的單糖組成 單位：%(摩爾百分比)

表2 胞內(nèi)多糖單中的糖組成 單位：%(摩爾百分比)

2.6 細(xì)胞壁成分分析

幾丁質(zhì)和葡聚糖為靈芝細(xì)胞壁的主要成分,為分析靈芝細(xì)胞壁成分的變化,菌體中幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。菌株T1和T2的幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖含量均下降。β-葡聚糖作為真菌細(xì)胞壁外層的主要成分,在細(xì)胞壁的外部結(jié)構(gòu)中起著重要作用,幾丁質(zhì)具有很高的抗張強(qiáng)度,有助于細(xì)胞壁的完整性[21]；幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖含量的降低會(huì)對(duì)細(xì)胞壁的完整性造成損害[22]。因此,轉(zhuǎn)化菌株的幾丁質(zhì)與β-1,3-葡聚糖含量的降低,影響了細(xì)胞壁的完整性,促進(jìn)多糖分泌至胞外,從而提高了單位菌體胞外多糖的含量。

a-幾丁質(zhì);b-β-1,3-葡聚糖圖6 細(xì)胞壁成分含量Fig.6 Content of cell wall components

3 結(jié)論與討論

在課題組前期對(duì)靈芝的全基因組序列注釋和全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析中,發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的基因GL24971,該基因編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。在靈芝中過(guò)表達(dá)該基因后,轉(zhuǎn)化菌株的生物量降低了37.5%,為4.16 mg/mL；單位菌體胞外多糖最大產(chǎn)量可達(dá)到0.07 mg/mg,提高了132.4%；胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為0.03 mg/mg,降低了10.7%；在分析單糖組分后發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)菌株的胞外多糖中葡萄糖比例提高且半乳糖比例基本降低到無(wú)法檢出,胞內(nèi)多糖中半乳糖比例顯著降低,葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971的過(guò)表達(dá)使得大量UDP-葡萄糖被合成和利用,因此多糖中葡萄糖的比例得到提高。同時(shí),根據(jù)糖供體合成途徑可知,UDP-葡萄糖可在UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)化為UDP-半乳糖,由于UDP-葡萄糖被葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971大量消耗,使得其流向UDP-半乳糖合成的量減少,從而導(dǎo)致胞內(nèi)外多糖中半乳糖組分的比例出現(xiàn)下降；過(guò)表達(dá)菌株細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量和β-1,3-葡聚糖的含量均下降,可能導(dǎo)致細(xì)胞壁的完整性受到損害,促使多糖更多地分泌至胞外,從而提高了單位菌體胞外多糖的產(chǎn)量。這些研究結(jié)果表明葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GL24971在多糖合成和細(xì)胞形態(tài)方面都具有重要的影響,這進(jìn)一步完善了靈芝多糖復(fù)雜的合成途徑,也為后續(xù)研究靈芝中的糖基轉(zhuǎn)移酶提供了參考。