氮磷硅對咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻繁殖速度和油脂積累的影響

王瑤華, 吳洪喜 , 黃振華 , 陳肖肖 , 胡 園 , 王召根,

(1.上海海洋大學 水產與生命學院, 上海 201306; 2.浙江省海洋水產養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005; 3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室, 浙江 溫州 325005)

能源短缺已成為當今世界面臨的三大問題(人口膨脹, 環(huán)境污染, 能源短缺)之一。隨著石化能源的日益枯竭, 綠色、清潔生物能的開發(fā)與利用已成為當今各國政府和科學家關注的熱點。微藻因具有繁殖速度快、含油量高、單位面積產量高等特點被認為是最具替代石化能潛力的新能源之一[1]。目前, 國內外許多研究結果表明, 氮、磷、硅對微藻的繁殖速度和油脂積累有較大的影響[2-5], 但研究的對象主要是綠藻類和浮游硅藻類, 對底棲硅藻的研究還鮮見報道。本文以溫州洞頭海區(qū)分離出的 2種富油底棲硅藻咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)和縊縮菱形藻(Nitzschia constricta)為研究對象, 探討了氮、磷、硅對其繁殖速度和油脂積累的影響, 為底棲硅藻的能源開發(fā)和利用積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器及試劑

藻種: 咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)、縊縮菱形藻(Nitzschia constricta), 均從洞頭自然海區(qū)中分離所得。

培養(yǎng)容器: 1000 mL錐形瓶。

主要儀器: 熒光分光光度計(型號: 960CRT, 上海精密科學儀器有限公司生產); 可見分光光度計(型號: 722型, 上海欣茂儀器有限公司生產); 智能光照培養(yǎng)箱(型號: ZDX-150, 寧波海曙賽福實驗儀器廠生產); 超聲清洗機(型號: SB-5200DT, 寧波新芝生物科技股份有限公司生產); 立式壓力蒸汽滅菌器(型號: LDZX型, 上海申安醫(yī)療器械廠生產)。

主要試劑: NaNO3(分析純); NaH2PO4(分析純);NaSiO3(分析純);尼羅紅(Nile red)(純度≥95%, 生工生物工程(上海)股份有限公司生產)。

1.2 方法

1.2.1 藻種的來源

采用水滴法和平板法從溫州洞頭海區(qū)掛板上的藻泥中分離出若干種底棲硅藻, 擴大培養(yǎng)后測定其總脂含量, 選定含脂肪較高的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻為研究對象。

1.2.2 試驗設計和培養(yǎng)基的制備

N、P、Si分別以f/2培養(yǎng)基為基礎, 各設置5個質量濃度水平, 分別為f/2培養(yǎng)基中相應質量濃度的1/7、1/5、1/3和9/7, 其他成分不變(表1), 各水平均設置2個重復。配置培養(yǎng)基用的海水取自當地海區(qū),鹽度 30、pH 8.2, 并經 0.45μm醋酸纖維膜過濾和120 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

表1 不同N、P、Si質量濃度的試驗設計Tab.1 The experiment design with different concentrations of N, P and Si

1.2.3 尼羅紅染色液的配制

稱9 mg尼羅紅粉末溶于30 mL丙酮, 搖勻, 取1 mL混合液加到2 mL丙酮中, 即得到100μg/mL尼羅紅染色液, 4℃避光保存。

1.2.4 接種與培養(yǎng)管理

取對數生長期的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻藻液離心濃縮, 用少量滅菌海水重懸, 取等量藻液分別接入按試驗設計配置的不同質量濃度的 N、P和 Si的培養(yǎng)基中。

控制試驗溫度(25±1)℃, 鹽度 30, 藻液不通氣,所有試驗均在光照培養(yǎng)箱中進行, 光暗比12 h∶12 h。

1.2.5 工作曲線的制定

1.2.5.1 細胞密度測定工作曲線的制定

取一定量的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻置于超聲清洗儀中均勻分散, 用可見分光光度計測定其在 680 nm下的A680(光密度), 并用血球計數板計數出相應的藻細胞密度, 得到A680與藻細胞密度的關系(圖1)和線性回歸方程:

圖1 咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻細胞密度與A680的關系Fig.1 The quantitative relationship between A680 and cell density of Amphora coffeaeformis and Nitzschia constricta

式中,Y為硅藻細胞密度(106個/mL);x為A680值。

兩者具有良好的線性關系, 本實驗 2種底棲硅藻細胞密度由測得的A680代入上述相應的公式(方程)求得。

1.2.5.2 油脂相對含量測定條件的確定

用熒光分光光度計, 以 485 nm 為激發(fā)光波長,在500~750 nm范圍內分別對海水、海水+尼羅紅、藻液、藻液+尼羅紅進行掃描, 由于海水自身在這個范圍內沒有自發(fā)熒光, 所以海水的發(fā)射光譜幾乎為一條直線; 海水+NR溶液在650 nm處有1個峰值,為尼羅紅在水中的自發(fā)熒光, 尼羅紅在水中溶解度很低, 故峰值較小; 藻液和藻液+NR的發(fā)射光譜在680 nm左右都有 1個峰值, 為葉綠素的發(fā)射峰; 藻液+NR在520~650 nm處出現1個很高的峰, 對比藻液的發(fā)射光譜, 可以推測出575 nm處為底棲硅藻的脂發(fā)射峰(圖2)。

圖2 海水和藻液及其被尼羅紅染色后的發(fā)射光譜掃描圖Fig.2 Fluorescence emission spectra of seawater and microalgel before and after dyeing

向等體積、同密度的藻液中加入不同質量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL)的尼羅紅,進行熒光檢測。結果顯示尼羅紅在1.0 μg/mL質量濃度時獲到最大的熒光強度, 高于這一質量濃度,熒光強度反而下降。取一定量藻液, 稀釋成一定的密度梯度, 染色后檢測其熒光強度。結果顯示: 當A680<0.686時, 藻細胞密度與相對脂熒光強度的相關系數最大。底棲硅藻具有易沉底的特性, 選用偏低的細胞密度進行熒光檢測以減小誤差。

1.2.6 測定方法

1.2.6.1 硅藻藻細胞密度的測定

隔天將培養(yǎng)容器和藻液在超聲清洗機中充分震蕩, 均勻分散后, 取 3 mL藻液用分光光度計測定680 nm處的A680。根據A680和已經求出的工作曲線,計算出相應的硅藻細胞密度。

1.2.6.2 油脂相對含量的測定

隔天將培養(yǎng)容器和藻液在超聲清洗機中充分震蕩, 均勻分散后取3 mL藻液測定其在染色前后485 nm激發(fā)波長下 575 nm處的熒光強度(尼羅紅質量濃度1μg/mL)。相對熒光強度=熒光強度/細胞密度; 熒光強度=藻液染色后熒光強度－藻液染色前熒光強度－尼羅紅的自發(fā)熒光強度(均為 575 nm處的熒光強度)。

1.2.7 數據處理

用 SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 數據統(tǒng)計結果表示為平均值±標準差。

2 結果

2.1 氮對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂含量的影響

試驗結果顯示: NO3-N質量濃度為1.746 mg/L時,咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻都幾乎不繁殖, 且藻細胞從實驗的第7 天開始發(fā)白、衰亡。隨著NO3-N質量濃度的升高, 2種底棲硅藻的繁殖速度加快, 但當質量濃度達到8.820 mg/L后, 再繼續(xù)升高, 2種底棲硅藻的繁殖速度并不明顯加快(圖3和圖4)。從曲線可以看出 2種藻對氮質量濃度的適應范圍很相似, 只是咖啡雙眉藻對低氮的適應力稍強于縊縮菱形藻。方差分析表明: 15d時, 培養(yǎng)液中NO3-N質量濃度對2種底棲硅藻繁殖有顯著的影響(P<0.05)。

實驗表明, 不同NO3-N質量濃度下, 2種底棲硅藻的油脂含量均呈先降后升, 到指數生長末期后開始大量積累。實驗結束時(15d), 藻細胞油脂含量除質量濃度最低組(1.746 mg/L)沒有升高, 甚至降低外,其他組都有所升高, 但質量濃度越高, 油脂含量越低(脂熒光強度越低)。15.876 mg/L質量濃度組只有5.920 mg/L 質量濃度組的一半(圖3和圖4)。第7 天時顯微觀察顯示, 大部分底棲硅藻細胞已經死亡,但并未解體, 仍有部分油滴被包裹在硅質的細胞壁內, 所以雖然細胞密度下降, 其相對熒光強度并未快速下降。方差分析表明: 實驗結束時, 培養(yǎng)液中NO3-N質量濃度對 2種底棲硅藻油脂含量有顯著影響(P<0.05)。

圖3 不同NO3-N質量濃度下咖啡雙眉藻的繁殖曲線和油脂積累比較Fig.3 The growth curves and lipid accumulation of Amphora coffeaeformis under different NO3-N concentrations

圖4 不同NO3-N質量濃度下縊縮菱形藻的繁殖曲線和油脂積累比較Fig.4 The growth curves and lipid accumulation of Nitzschia constricta under different NO3-N concentrations

2.2 磷對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂含量的影響

結果顯示, 在實驗設計的 H2PO4-P質量濃度范圍內, 2種底棲硅藻均能正常生長, 藻細胞繁殖速度均隨H2PO4-P質量濃度的增高而加快, 但到了較高質量濃度(0.884 mg/L)后, 藻細胞的繁殖速度不再明顯加快, 從生長曲線可以看出, 咖啡雙眉藻較縊縮菱形藻更能適應低磷環(huán)境(圖5和圖6), 培養(yǎng)液H2PO4-P質量濃度對2種底棲硅藻繁殖有顯著影響(P<0.05)。

圖5 不同H2PO4-P質量濃度下咖啡雙眉藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.5 The growth curves and lipid accumulation of Amphora coffeaeformis under different H2PO4-P concentrations

隨著H2PO4-P質量濃度的增高, 2種底棲硅藻細胞的油脂含量均呈現先降后升的變化規(guī)律, 且低質量濃度的磷更有利于2種底棲硅藻細胞脂肪的積累。實驗結束(15 d)時, 咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻細胞的油脂含量, 低磷質量濃度(0.164 mg/L)組分別是最高磷質量濃度(1.500 mg/L)組的1.3倍和1.6倍(圖5和圖6), 低質量濃度磷對縊縮菱形藻油脂的影響大于咖啡雙眉藻。培養(yǎng)液中H2PO4-P質量濃度對2種底棲硅藻油脂含量的影響, 除高于 0.884 mg/L質量濃度組外, 其余均呈顯著影響(P<0.05)。

圖6 不同H2PO4-P質量濃度下縊縮菱形藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.6 The growth curves and lipid accumulation of Nitzschia constricta under different H2PO4-P concentrations

2.3 硅對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂積累的影響

硅對 2種硅藻的生長情況影響相似, 在實驗設計的質量濃度范圍內, SiO3-Si質量濃度對 2種底棲硅藻繁殖速度的影響均隨質量濃度的增加而升高(圖7和圖8), 且呈顯著性(P<0.05), 但當質量濃度達1.532 mg/L后, 繼續(xù)升高對2種底棲硅藻細胞繁殖速度的影響變?yōu)椴伙@著(P>0.05)。實驗后期發(fā)現, 低質量濃度組硅藻細胞較高質量濃度組硅藻細胞先老化,可見, 硅有利于硅藻繁殖周期的延長。

硅對2種底棲硅藻油脂積累影響與氮、磷相似,隨著SiO3-Si質量濃度的增高, 藻細胞脂肪含量也呈升高→降低→升高的規(guī)律變化, 較低質量濃度的硅(低于0.919 mg/L)更有利于硅藻細胞油脂的積累。在實驗設計的質量濃度范圍內, 實驗結束(15 d)時, 咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻的油脂含量, 最低硅質量濃度組(0.307mg/L)分別是最高硅質量濃度組(2.758 mg/L)的1.3倍和1.5倍(圖7和圖8), 低質量濃度的SiO3-Si更有利于2種底棲硅藻的油脂積累。方差分析表明: 實驗結束(15d)時, SiO3-Si對2種底棲硅藻油脂含量的影響, 質量濃度低于1.532 mg/L影響顯著(P<0.05),質量濃度高于1.532 mg/L影響不顯著(P>0.05)。

圖7 不同SiO3-Si質量濃度下咖啡雙眉藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.7 The growth curves and lipid accumulation of Amphora coffeaeformis under different SiO3-Si concentrations

圖8 不同SiO3-Si質量濃度下縊縮菱形藻的繁殖曲線和油脂積累Fig.8 The growth curves and lipid accumulation of Nitzschia constricta under different SiO3-Si concentrations

3 討論

3.1 環(huán)境脅迫可能是促進硅藻細胞積累油脂的直接原因

添加不同質量濃度的N、P、Si營養(yǎng)培養(yǎng)實驗表明, 縊縮菱形藻和咖啡雙眉藻的相對油脂含量總體呈現先降低后升高的趨勢。前期油脂含量的降低可能是由為硅藻細胞進入新的環(huán)境, 需要一個適應的過程, 到指數生長期或更遲, 培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)元素, 即將被消耗盡, 于是硅藻細胞開始積累油脂。N、P和Si越早被消耗完, 硅藻細胞越早開始積累油脂, 其油脂積累也越多?？梢? 不利的環(huán)境條件, 尤其是營養(yǎng)鹽的缺乏, 更有利于硅藻細胞油脂的積累。

3.2 氮質量濃度對縊縮菱形藻和咖啡雙眉藻的繁殖和油脂含量的影響

N對底棲硅藻繁殖速度的影響已見不少報道[6-7]。本實驗結果表明, 咖啡雙眉藻繁殖適宜的氮質量濃度為5.920~8.82 mg/L, 較李雅娟等[6](咖啡雙眉藻最適氮質量濃度為2.5~5 mg/L)和王起華等[8](咖啡雙眉藻最適氮質量濃度為1.54~6.16 mg/L)的研究結果高,這可能是由于本實驗的藻種分離于營養(yǎng)鹽較高的海區(qū), 該藻株產生了耐高營養(yǎng)鹽特性; 縊縮菱形藻適宜的氮質量濃度為 8.82 ~15.876 mg/L, 較董金利報道[9]的縊縮菱形藻在>12.35 mg/L才能繁殖要低, 這可能是因為董金利在1.23 ~12.35 mg/L區(qū)間內沒有設置實驗組, 影響了實驗精度。氮是構成蛋白質的必要成分, 在缺氮情況下藻細胞形成的蛋白質量減少,硅藻光合作用形成的能量物質有可能更多地轉向合成油脂[10]。Chelf[11]認為不同的氮源質量濃度對油脂積累有很大影響, 且目前普遍認為氮缺乏會導致微藻細胞內大量積累油脂[12-13], 本實驗也印證了這一規(guī)律, 培養(yǎng)液中不同氮質量濃度對 2種底棲硅藻繁殖和油脂含量的影響均較大, 適當降低培養(yǎng)基中氮質量濃度有利于油脂的積累。

3.3 磷質量濃度對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂含量的影響

2種底棲硅藻繁殖速度隨培養(yǎng)基中磷質量濃度的增高而加快, 在 0.884~1.500 mg/L范圍內均能正常繁殖, 這一現象符合藻類利用磷的特點, 大多數微藻能夠主動吸收磷, 當環(huán)境磷充足時, 細胞將吸收的多于生理需要的磷儲存于細胞內, 環(huán)境缺磷時又可利用這些儲存的磷進行代謝[14]。一些藻類磷缺乏也能提高其油脂含量, 如三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)、角毛藻(Chaetoceros)、巴夫藻(Pavlova viridis)等; 而另一些藻類磷缺乏反而導致油脂含量的降低, 如屠夫綠球藻(Nannochloris atomus)和融合微藻(Tetraselmissp.)[15]。本實驗的咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻屬于前者, 但磷缺乏較氮缺乏對藻細胞油脂積累的影響要小。隨著磷質量濃度的降低, 藻細胞中油脂的含量回升越早, 這可能是因為低初始質量濃度的磷可以較早地激活油脂合成途徑。

3.4 硅質量濃度對 2種底棲硅藻的繁殖和油脂積累的影響

本實驗中, 硅質量濃度在所設范圍內, 2種底棲硅藻均能正常繁殖, 但差異較小, 硅質量濃度的增加沒有明顯地促進 2種底棲硅藻的繁殖, 且低初始硅質量濃度對 2個藻株繁殖的影響沒有低初始氮、磷質量濃度的顯著。董金利[9]、馬志珍等[16]、王淵源等[17]報道在實驗室內用自然海水培養(yǎng)底棲硅藻, 即使不加硅鹽仍能良好繁殖。大貝政治等采用營養(yǎng)去除法的實驗發(fā)現, 用不含硅的人工海水培養(yǎng)基培養(yǎng)一種卵形藻時, 對其生長的抑制作用很小。本實驗中低硅質量濃度組獲得較高的油脂相對含量, 這是因為硅缺乏會引起油脂合成過程中起作用的乙酰-CoA羧化酶活力的增強[10], 低初始硅質量濃度對 2個藻株繁殖的影響沒有低初始氮、磷質量濃度影響的顯著(PN

本實驗僅研究了氮、磷、硅單因子對硅藻細胞油脂積累的影響, 事實上營養(yǎng)鹽的配比(主要是氮磷比)對藻類的代謝產物和繁殖速率也有顯著的影響[7,19-20],因此多因子組合對 2種底棲硅藻繁殖速度和油脂積累影響還需要進一步深入實驗和探討。

[1] Yusuf C.Biodiesel from microalgae[J].Biotechnology Advances, 2007, 25(3): 294-306.

[2] 王曉青, 王嫁, 江雪, 等.三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)油脂富集培養(yǎng)的研究[J].四川大學學報(自然科學版), 2011, 48(3): 691-696.

[3] 魏東, 張學成.氮源和 N/P對眼點擬微綠球藻的生長、總脂含量和脂肪酸組成的影響[J].海洋科學,2000, 24(7): 46-50.

[4] Evans C T, Ratledge C.Influence of Nitrogen Metabolism on Lipid Accumulation by Rhodosporidium to ruloides CBS14[J].Gen Microbiol, 1984, 130(7): 1704-1705.

[5] Yoon S H, Rhee J A.Quantitative Physiology of Rhodotorula glutinis for Microbial lipid Production[J].Process Biochem, 1983, 18(5): 2-4.

[6] 李雅娟, 王起華.氮、磷、鐵、硅營養(yǎng)鹽對底棲硅藻生長速率的影響[J].大連水產學院學報, 1998, 13(4):7-14.

[7] 郭峰, 朱凌俊, 柯才煥, 等.兩種海洋底棲硅藻的培養(yǎng)條件研究[J].廈門大學報(自然科學版), 2005, 44(6):831-835.

[8] Wang Qa, Li M , Wang S, et al.Studies on culture conditions of bent hic diatoms for feeding abalone: ⅡEffects of salinity, pH, nitrogenous and phosphate nutrients on growth rate[J].Chin J Oceanol Limnol ,1998, 16 (1) : 78-83.

[9] 董金利.海洋底棲硅藻Nitzschia constrict的分離、培養(yǎng)及固定化研究[D].福州: 福建師范大學,2010.

[10] 程軍, 葛婷婷, 馮佳, 等.硅藻生長優(yōu)化富集油脂的促進機理[J].新能源及工藝, 2010, 4: 27-32.

[11] Chelf P.Environmental control of lipid and biomass production in two diatom species[J].Journal of Applied Phycology, 1990, 2: 121-130.

[12] Li Y, Han D, Sommerfeld M, et al.Photosynthetic carbon partitioning and lipid production in the oleaginous microalgaPseudochlorococcumsp.(Chlorophyceae)under nitrogen-limited conditions[J].Bioresource Technology,2011, 102 (1): 123-129.

[13] Coverti A, Casazza A A, Ortiz E Y, et al.Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content ofNannochloropsis oculataandChlorella vulgarisfor biodiesel production[J].Chemical Engineering and Processing: Process Intensification,2009, 486: 1146-1151.

[14] 王軍, 楊素玲, 叢威, 等.營養(yǎng)條件對產烴葡萄藻生長的影響[J].過程工程學報, 2003, 32: 141-145.

[15] Reitan K I, Rainuzzo J R, Olsen Y.Effect of nutrient limitation on fatty acid and lipid content of marine microalgae[J].Phycol, 1994, 30(6): 972-979.

[16] 馬志珍, 季梅芳, 陳匯遠.一種可作為鮑和海參餌料的底棲舟形藻的培養(yǎng)條件的研究[J].海洋通報, 1985,4(4): 36-39.

[17] 王淵源, 姜慶國, 江航宇.培養(yǎng)小形舟形藻的氮、磷肥料量[J].1986, 10(5): 35-37.

[18] Mortensen S H, Borsheim K Y, Rainuzzo J, et al.Fatty acid and elemental composition of the marine diatomChaetoceros gracilisSchütt.Effects of silicatedeprivation, temperature and light intensity.[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1988,122(2): 173-185.

[19] 李文權, 蔡阿根, 王憲, 等.光和營養(yǎng)鹽對三角褐指藻生化組成的影響[J].中國環(huán)境科學, 1994, 14(3):185-189.

[20] 張立言, 向保卿, 馬志珍.兩種硅藻生長繁殖條件的研究[J].海洋水產研究, 1982, 4: 79-87.