中國(guó)鱟基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建及分析

寧曄鳳 , 黎中寶 , 戴 剛 , 上官靜波 , 李清薈

(1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門(mén) 361021; 2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門(mén)361021)

中國(guó)鱟(Tachypleus tridentatus)又名三刺鱟、小海鱟或東方鱟, 是大型海洋底棲動(dòng)物, 其祖先可追溯至4億多年前, 是動(dòng)物界少數(shù)現(xiàn)存珍貴的“活化石”[1]。它隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura)、鱟科(Limulidae)、鱟屬(Tachypleus), 主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江口以南、日本九州島以南、爪哇島以北海域[2]。中國(guó)鱟具有極高的經(jīng)濟(jì)、藥用及科學(xué)研究?jī)r(jià)值, 其血液制品鱟試劑是目前檢測(cè)內(nèi)毒素應(yīng)用最廣、最有效的試劑[3], 且其微妙的視神經(jīng)系統(tǒng)使得它成為生理學(xué)和仿生學(xué)研究的重要模型[4]。然而近些年來(lái), 棲息地生境的破壞、人類(lèi)大規(guī)模濫捕濫殺等原因造成了中國(guó)鱟數(shù)量銳減, 野生資源幾近枯竭[5], 加之其生長(zhǎng)周期從卵細(xì)胞受精至成熟需要 13~15年, 中國(guó)鱟的保育工作迫在眉捷[6]。目前,福建、浙江、廣東、海南及廣西省已將中國(guó)鱟列為省級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物, 因此, 進(jìn)行中國(guó)鱟資源保護(hù)及開(kāi)展相關(guān)基礎(chǔ)研究顯得十分需要。

微衛(wèi)星即為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat, STR), 是由中央核心序列和兩側(cè)保守側(cè)翼序列組成的, 核心序列為少數(shù)幾個(gè)核苷酸(2~6個(gè))組成的串聯(lián)重復(fù)核苷酸序列。由于微衛(wèi)星分子遺傳標(biāo)記技術(shù)所具有的易分離、共顯性、多態(tài)性高、信息含量多、關(guān)聯(lián)性好等優(yōu)點(diǎn)[7], 使得其在物種遺傳多樣性分析研究上比其他DNA標(biāo)記技術(shù)更適合, 并因此在瀕危動(dòng)物種群遺傳學(xué)及保護(hù)遺傳學(xué)中得到越來(lái)越多的應(yīng)用[8-9]。中國(guó)鱟作為重要的野生保護(hù)動(dòng)物之一, 目前國(guó)內(nèi)對(duì)中國(guó)鱟的研究多見(jiàn)于資源分布及保育方面[10-11],中國(guó)鱟微衛(wèi)星標(biāo)記分離方面的研究還有很大空缺,目前相關(guān)研究?jī)H見(jiàn)于Li等[12]開(kāi)發(fā)出7對(duì)多態(tài)微衛(wèi)星引物。

本研究采用生物素標(biāo)記的(GT)15、(CT)15混合探針雜交與磁珠富集法相結(jié)合從中國(guó)鱟基因組中構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù), 通過(guò)克隆、測(cè)序、設(shè)計(jì)引物和PCR檢測(cè)來(lái)獲得多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記, 為進(jìn)一步研究中國(guó)鱟群體遺傳多樣性, 種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析奠定基礎(chǔ),且為其野生種質(zhì)資源保護(hù)及評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中國(guó)鱟樣品采自福建省廈門(mén)市集美水產(chǎn)品市場(chǎng),平均體長(zhǎng)為35.6 cm。剪取樣品附肢肌肉于95%乙醇中固定, 并于–20℃保存。

1.2 基因組 DNA 的提取與檢測(cè)

基因組 DNA采用試劑盒提取法。具體操作步驟按照天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒-離心柱型/DP304(天根生化科技有限公司, 北京)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)K5500超微紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提基因組 DNA 的純度和濃度后, 取 2 μL 基因組DNA 進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠小樣量樣品電泳檢測(cè)其DNA完整性, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶切及接頭連接

基因組DNA選用FastDigest Tru1I酶(Fermentas)進(jìn)行快速酶切, 并選取400 bp~1 000 bp片段進(jìn)行連接。等摩爾比混合兩組寡核苷酸鏈 LinkerA(5'-GACGATGAGTCCTGAG-3')及LinkerB (5'-TACTCA GGACTCAT-3'), 95℃變性10 min, 37℃10 min, 冰置10 min, 形成終濃度為 10 μmol/L 的雙鏈接頭供連接體系使用。

建立30 μL的連接體系, 其中包括酶切產(chǎn)物20 μL,雙鏈接頭 5μL (10μmol/L), T4 連接酶(5 U/μL)1 μL,10×T4 buffer 4 μL, 于 22℃連接過(guò)夜。

1.4 微衛(wèi)星文庫(kù)的構(gòu)建

1.4.1 雜交

將10 μL接頭連接產(chǎn)物于95℃變性 10 min, 迅速置于冰上使雙鏈分開(kāi)。取變性后的連接產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的 Bio-(CT)15、Bio-(GT)15混合探針進(jìn)行雜交反應(yīng), 反應(yīng)體系為 50 μL , 其中包括 25 μL 已預(yù)熱至55℃的緩沖液2×Hyb buffer, 10 μL 接頭連接產(chǎn)物, 5μL Bio-(CT)15(10μmol/L), 5 μL Bio-(GT)15(10 μmol/L) 以及 5 μL ddH2O。61℃雜交 1 h, 放置 4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 磁珠富集純化

1.4.2.1 平衡磁珠

取150 μL混勻后的磁珠(Promega, USA)原液于1.5 mL離心管。而后置于磁力架上吸附磁珠, 輕輕吸出上清鹽保護(hù)液。用150 μL(等比例)0.5×SSC于室溫下洗滌磁珠兩遍, 最后加入150 μL 1×Hyb buffer重懸磁珠。

1.4.2.2 磁珠的富集

于已平衡好的重懸磁珠液中加入 50 μL雜交產(chǎn)物混勻, 室溫下放置30 min, 期間每5 min用移液槍輕輕吹打混勻 1 次, 30 min 后將離心管置于磁力架上,吸去上清液。之后將離心管放置于磁力架上于室溫下依次用 400 μL 洗脫液 I(2×SSC, 0.1% SDS)和400 μL 洗脫液Ⅱ(1×SSC, 0.1% SDS)各洗脫2次。最后再用已提前預(yù)熱至 50℃的 洗脫液Ⅱ(1×SSC, 0.1%SDS)400 μL快速洗脫兩次。即可基本將不含微衛(wèi)星的以及與探針結(jié)合不牢固的片段去除干凈。

1.4.2.3 捕獲微衛(wèi)星片段

洗脫完成后, 在洗脫液中加入200 μL TE混合均勻, 95℃溫育 10 min后, 將釋放出含有單鏈微衛(wèi)星序列的片段, 迅速將其置于磁力架上吸取上清液轉(zhuǎn)至新離心管中。

1.4.2.4 純化富集微衛(wèi)星片段

在上述制備好的含有微衛(wèi)星片段的溶液中加入400 μL, –20 ℃ 預(yù)冷的無(wú)水乙醇, 并加入 22 μL NaAc/EDTA(pH8.0)螯合劑助沉, 冰置15 min后4℃, 12 000 r/min 離心 10 min, 棄上清。再加入 500 μL, –20℃預(yù)冷的 75%乙醇, 冰置 15 min后4℃, 12 000 r/min離心10 min, 棄上清, 室溫風(fēng)干樣品。最后用25 μL TE溶液溶解微衛(wèi)星DNA, 放置4℃過(guò)1~2 d待微衛(wèi)星 DNA 充分溶解后方可使用。

1.5 產(chǎn)物擴(kuò)增及純化

建立 25 μL 擴(kuò)增體系, 用 MseI primer(MseI adapterA)為引物對(duì)富集純化所得微衛(wèi)星 DNA 片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括精制產(chǎn)物2 μL, 10×Taq Buffer(含 Mg2+) 4 μL, dNTPs(10mmol/L)0.4 μL, Taq聚合酶(5U/μL)0.2 μL, MseI primer 引物 1.4 μL(10 μmol/L), 17 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性 2 min, 32×(95℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 40 s),最后 72℃, 20 min 完成擴(kuò)增片段末端加poly A。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段。選取片段400 bp~1 000 bp的產(chǎn)物, 用 GenCleanPCR回收試劑盒(上海捷瑞)純化, 去除多余的dNTPs 和接頭等雜質(zhì)。

1.6 載體連接、富集文庫(kù)的篩選及測(cè)序

取2 μL純化產(chǎn)物與pMD19-T載體(Takara, Japan)于16℃連接3.5 h, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌 DH5α中培養(yǎng), 得到中國(guó)鱟微衛(wèi)星基因組文庫(kù)。挑選陽(yáng)性單克隆菌接種于含有氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中, 37℃振蕩培養(yǎng) 3.5 h。隨后用 M13F/R通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增篩選檢測(cè), 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 挑取片段為400 bp~1 000 bp的陽(yáng)性克隆菌液送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 序列分析與引物設(shè)計(jì)

利用 NCBI載體查找工具 VecScreen 去除兩側(cè)的載體引物, 匯總所有輸出序列后再利用微衛(wèi)星查找軟件SSRHunter 1.3 對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行查找。獲得的微衛(wèi)星序列按完美型, 非完美型和復(fù)合型人工細(xì)化分析。并用 Primer Premier version 5.0對(duì)所得的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆與測(cè)序結(jié)果

經(jīng)PCR檢測(cè)篩選, 本研究共獲得334個(gè)陽(yáng)性克隆,從中隨機(jī)選取196個(gè)片段大小為400 bp~1 000 bp的陽(yáng)性克隆送出測(cè)序。圖1為部分篩選結(jié)果的電泳圖。

圖1 單克隆檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Partial results of the positive monoclonal PCR detection

2.2 微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分析

在送出的 196個(gè)陽(yáng)性克隆的測(cè)序過(guò)程中, 有 18條微衛(wèi)星序列測(cè)序出現(xiàn)中斷, 測(cè)序失敗, 占所有克隆的9.08%。這部分的測(cè)序結(jié)果顯示, 在單個(gè)克隆中有多處微衛(wèi)星重復(fù)序列, 有的甚至高達(dá) 6 處, 并且重復(fù)次數(shù)通常大于30次, 復(fù)雜的堿基重復(fù)可能是導(dǎo)致測(cè)序過(guò)程出現(xiàn)信號(hào)衰減、測(cè)序峰圖紊亂、測(cè)序中斷的原因。圖2為單向測(cè)序測(cè)通的中國(guó)鱟基因組中微衛(wèi)星的特征序列部分峰圖。

圖2 中國(guó)鱟基因組中微衛(wèi)星特征序列(CAAA)nFig.2 Diagram of (CAAA)n repeat sequence in Tachypleus tridentatus

本研究利用磁珠富集獲得的中國(guó)鱟基因組微衛(wèi)星最大重復(fù)次數(shù)為 98次, 大多集中在 7~35次, 占82.6%; 最高在5~10次, 為29.5%, 多數(shù)是二核苷酸堿基重復(fù)7次以上的微衛(wèi)星序列; 50次以上的頻率為10.2%(圖3)。

圖3 中國(guó)鱟微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)與分布頻率Fig.3 Distribution frequency of microsatellite repeat times in Tachypleus tridentatus

2.3 微衛(wèi)星序列結(jié)果及分類(lèi)

利用SSR hunter 1.3軟件對(duì)去除載體引物后的序列進(jìn)行微衛(wèi)星序列的查找, 使用的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Linda[13]對(duì)微衛(wèi)星的劃定標(biāo)準(zhǔn): 單堿基重復(fù)大于 14次, 雙堿基重復(fù)大于7次, 三堿基重復(fù)大于5次, 四堿基及五堿基重復(fù)大于4次。結(jié)果顯示, 在178個(gè)成功測(cè)序的陽(yáng)性克隆中共獲得 127個(gè)微衛(wèi)星序列, 其中完美型占 69.3%; 非完美型占 11.0%; 復(fù)合型 占 19.7%(表1)。除探針使用的GT和CT的重復(fù)序列外, 還篩選到多堿基 GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA 的重復(fù)序列。部分微衛(wèi)星詳細(xì)信息可見(jiàn)表2。

表1 中國(guó)鱟基因組微衛(wèi)星序列分類(lèi)情況Tab.1 Systematization of microsatellites in T.tridentatus

表2 部分微衛(wèi)星位點(diǎn)引物及其他相關(guān)信息Tab.2 Relevant information of part of microsatellite primer sequences of T.tridentatus

2.4 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增結(jié)果分析

利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier version 5.0對(duì)所得到的序列設(shè)計(jì)引物, 在 127個(gè)微衛(wèi)星序列中,有43個(gè)微衛(wèi)星座位由于位于序列的末端或沒(méi)有足夠的側(cè)翼序列無(wú)法設(shè)計(jì), 在有側(cè)翼的 84個(gè)序列中, 然后為選定的序列設(shè)計(jì) PCR引物, 在 moderate stringency條件下[溫度: 45.0~70.0℃, GC含量: 40%~60%; 引物長(zhǎng)度: (21±4) bp; PCR產(chǎn)物大小: 100~330 bp], 有56個(gè)序列可設(shè)計(jì)出引物, 本研究選擇合成40對(duì), 其中有19對(duì)可擴(kuò)增出清晰目的條帶, 16對(duì)表現(xiàn)出單一條帶, 3對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性。圖4為T(mén)F-4位點(diǎn)擴(kuò)增圖譜。目的片段為237bp處, 顯示出多態(tài)性。

圖4 中國(guó)鱟TF-4位點(diǎn)擴(kuò)增圖譜Fig.4 Electrophoretogram of TF-4 locus in T.tridentatus

3 討論與結(jié)論

3.1 酶切片段的大小及酶的種類(lèi)

構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)文庫(kù)時(shí), 使用的酶切片段大小應(yīng)適宜, 過(guò)長(zhǎng)的片段易導(dǎo)致親和捕捉不到, 后續(xù)難以擴(kuò)增, 影響測(cè)序結(jié)果, 增加實(shí)驗(yàn)成本; 過(guò)短的片段則很難保證微衛(wèi)星側(cè)翼序列長(zhǎng)度, 影響引物的設(shè)計(jì), 進(jìn)而影響多態(tài)性引物的篩選。從便于提高實(shí)驗(yàn)有效性角度來(lái)看, 本實(shí)驗(yàn)選用400~1 000 bp大小的酶切片段是合理的。在選擇限制性內(nèi)切酶上, 本實(shí)驗(yàn)選用FastDigest Tru1I酶(Fermentas)是由于其酶切位點(diǎn)在動(dòng)物基因組中分布廣泛, 可以將基因組DNA均勻地切成大小不同的片段, 且反應(yīng)速度很快, 大大縮減了實(shí)驗(yàn)用時(shí), 既保證了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性、微衛(wèi)星位點(diǎn)隨機(jī)性, 又保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的高效性和真實(shí)性。

3.2 探針的選擇

在所有動(dòng)物基因組中(CA)n或(GT)n微衛(wèi)星的含量最為豐富, 其次是(CT)n[14]。本研究選用(GT)n為探針進(jìn)行富集和雜交。為了提高微衛(wèi)星的富集效率,Edwards[15]等提出用多種探針來(lái)篩選文庫(kù)被廣泛應(yīng)用。Stamati[16]等利用(CA)15、(GA)8、(AAG)8和(ATG)8為探針構(gòu)建了Salix lanata基因組文庫(kù), 李齊發(fā)等[17]選擇(CA)12、(CCG)8、(CAG)8和(TTTC)8混合探針富集牦牛微衛(wèi)星, 均證實(shí)了應(yīng)用多種探針混合進(jìn)行雜交分離微衛(wèi)星片段是增加微衛(wèi)星種類(lèi)的理想選擇。因此本研究在(GT)15的基礎(chǔ)上又采用了(CT)15探針,以期獲得更多的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。此外, 探針選用時(shí)堿基數(shù)要適中, 探針堿基對(duì)的增加會(huì)直接影響到雜交的效率, 堿基對(duì)越多越難雜交。所以在以后的研究中, 根據(jù)研究對(duì)象特點(diǎn)選用相應(yīng)合適的混合探針,是成功獲得更多微衛(wèi)星種類(lèi)的必要條件。

3.3 微衛(wèi)星序列特征及擴(kuò)增結(jié)果分析

本研究中獲得的微衛(wèi)星序列中, 完美型微衛(wèi)星占69.3%、不完美型占11.0%、復(fù)合的占19.7% 其中完美型微衛(wèi)星比例最高, 此結(jié)果與日本盤(pán)鮑(Paralichthys olivaceus)[18]、細(xì)角螺(Hemifusus ternatanus)[19]、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)[20]、劍尾魚(yú)(Xiphophorus helleri)[21]、海灣扇貝(Argopecten irradians)[22]以及大珠母貝(Pinctada maxima)[23]等水產(chǎn)動(dòng)物的微衛(wèi)星序列特點(diǎn)基本相符。微衛(wèi)星核心序列相對(duì)較高的突變率, 是微衛(wèi)星多態(tài)性的基礎(chǔ)。根據(jù)Weber等[24]的觀點(diǎn), 重復(fù)次數(shù)高的微衛(wèi)星在種群中表現(xiàn)出的多態(tài)性高。本研究所得序列重復(fù)次數(shù)多集中在7~35, 占82.6%, 最高達(dá)到98次。但是高重復(fù)性序列往往周?chē)鷤?cè)翼序列不足, 或是1個(gè)克隆中出現(xiàn)多處微衛(wèi)星序列, 復(fù)雜的堿基重復(fù), 導(dǎo)致測(cè)序峰圖紊亂以至于引物設(shè)計(jì)困難。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示, 合成的引物 40對(duì)經(jīng)擴(kuò)增后,有19對(duì)可擴(kuò)增出清晰目的條帶。其中有16對(duì)表現(xiàn)出單一條帶, 3對(duì)具有多態(tài)性。其余的因存在無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物, 擴(kuò)增產(chǎn)物與目的條帶長(zhǎng)度不一致, 擴(kuò)增圖譜個(gè)體缺失嚴(yán)重等導(dǎo)致無(wú)法判定。出現(xiàn)這些情況的原因可能是由于某些引物序列特異性不好, 無(wú)法擴(kuò)增出產(chǎn)物, 某些引物與基因組中序列錯(cuò)配, 導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度改變, 或是有些個(gè)體基因突變, 無(wú)法與引物結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)篩選出的微衛(wèi)星引物可為中國(guó)鱟遺傳多樣性分析的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ), 為以后中國(guó)鱟的遺傳育種、種苗放流等提供基礎(chǔ)理論依據(jù), 這對(duì)于后期實(shí)現(xiàn)其種質(zhì)資源保護(hù)及科學(xué)的管理具有重要意義。

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