泥蚶人工選育群體的微衛(wèi)星分析

田 野 , 邵艷卿, , 肖國(guó)強(qiáng), , 滕爽爽, , 柴雪良 , , 張炯明, , 方 軍,

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325005; 2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005; 3.浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)和保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 溫州 325005)

泥蚶(Tegillarca granosa)屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、蚶目(Arcoida)、蚶科(Arcidae)動(dòng)物,廣泛分布于我國(guó)南北各沿海地區(qū)及韓國(guó)、越南、馬來(lái)西亞等, 為我國(guó)傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。因其具有獨(dú)特的風(fēng)味及豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受人們喜愛(ài)。20世紀(jì)90年代初期, 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所等單位率先突破了泥蚶規(guī)?；a(chǎn)性人工育苗技術(shù), 自此以后, 泥蚶養(yǎng)殖獲得快速發(fā)展, 泥蚶養(yǎng)殖所用苗種也絕大部分由人工苗種所替代[1]。浙江樂(lè)清灣一帶也成為國(guó)內(nèi)最主要的泥蚶人工苗種產(chǎn)地。

但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 因長(zhǎng)期以來(lái)生產(chǎn)性養(yǎng)殖的泥蚶, 主要通過(guò)人工育苗提供苗種, 苗種繁育所用親貝均為人工養(yǎng)成, 經(jīng)過(guò)多年自繁自養(yǎng)和親貝的隨意選留, 加劇了泥蚶的近交衰退, 已不同程度地出現(xiàn)了遺傳多樣性減低、雜合度下降、生長(zhǎng)速度減緩、抗逆性差、性狀退化等問(wèn)題[2]。微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeat, SSR), 具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好、操作分析簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn), 已被廣泛用于群體遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域[3]。進(jìn)行選育時(shí), 因近交機(jī)率增加和有效親本數(shù)的減少, 可能導(dǎo)致選育群體的遺傳多樣性下降, 進(jìn)而引起選育群體的性狀衰退[4], 雖然一些研究報(bào)道了貝類養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與野生群體相比未發(fā)生明顯變化[5-8], 但貝類的苗種培育和群體選育過(guò)程中, 常因親本數(shù)量過(guò)少、雌雄比例不當(dāng)、親本貢獻(xiàn)不均、配子質(zhì)量差異、配子競(jìng)爭(zhēng)、人工選優(yōu)和選型交配等因素, 引起有效群體數(shù)量的減少,從而降低選育群體的遺傳多樣性[9-14]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于貝類選育群體遺傳多樣性的分析已有不少報(bào)道: 王慶志等[15]對(duì)長(zhǎng)牡蠣人工選育群體的微衛(wèi)星分析; 王學(xué)穎等[16]對(duì)馬氏珠母貝金黃殼色系和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較; 本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)泥蚶連續(xù) 3代選育群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析, 與基礎(chǔ)群體進(jìn)行比較, 考查隨著選育代數(shù)的進(jìn)行群體各種遺傳指數(shù)的變化規(guī)律, 為進(jìn)一步優(yōu)化育種方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

本研究采集的泥蚶樣品為經(jīng)浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所連續(xù)多年選育的F3代, F4代, F5代速生群體, 選育策略為群體內(nèi)個(gè)體選擇結(jié)合家系/亞群選擇,同時(shí)以最早保存的未經(jīng)選育的基礎(chǔ)群體作為對(duì)照組。F3, F4, F5代個(gè)體均從群體中隨機(jī)選取65個(gè), 于–70℃冰箱中保存?zhèn)溆? 基礎(chǔ)群體35個(gè)于2007年保存在–70℃冰箱備用。

1.2 DNA提取

采用常規(guī)的蛋白酶 K 消化, 酚-氯仿-異戊醇抽提, 無(wú)水乙醇沉淀的方法提取基因組 DNA; 用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度與濃度, 選取電泳條帶較亮且濃度較高的DNA稀釋成統(tǒng)一濃度, 保存于4℃冰箱中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

從39對(duì)泥蚶微衛(wèi)星引物中[17]篩選出12對(duì)作為本研究使用的引物, 并對(duì)引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。引物由上海生工公司合成, 其編號(hào)及序列見(jiàn)表1。

表1 引物編號(hào)及序列Tab.1 Primer number and sequences

PCR反應(yīng)體系為15 μL, 包含100 ng模板DNA,1×PCR緩沖液, 0.4UTaKaRa Taq DNA聚合酶, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.25 mmol/L dNTP混合液, 上下游引物各0.7 μmol/L。PCR擴(kuò)增條件為: 94℃ 預(yù)變性5 min,然后30個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)包括: 94℃ 30 S, 49~56℃退火30 S, 72℃延伸45 S。PCR產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳, 50 bp DNA ladder (Takara)作為Marker檢測(cè)產(chǎn)物位置, 硝酸銀法染色, 條帶結(jié)果由人工讀取、統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)量(Observed number of allele,No), 用 Popgene 32(1.32)分析數(shù)據(jù), 計(jì)算有效等位基因數(shù)(Effective number of allele,Ne),Shannon遺傳多樣性指數(shù)(Shannon genetic ranged index,Rs), 近交系數(shù)(Wright's fixation index,Fis), 觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity,Ho), 期望雜合度(Expected heterozygosity,He)以及哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。PIC_Calc 0.6(http://www.bbioo.com/download/58-247-1.html)計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

泥蚶基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳參數(shù)結(jié)果如表2所示。12個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性: 基礎(chǔ)群體各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)1.69~6.30個(gè), 平均3.16個(gè); F3代為1.52~3.88個(gè), 平均2.71個(gè); F4代1.15~4.75個(gè), 平均2.73個(gè); F5代1.57~5.17個(gè), 平均2.58個(gè); 表明隨著群體選育的進(jìn)行, 等位基因數(shù)總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。所有群體12個(gè)位點(diǎn)觀測(cè)雜合度(Ho)均小于期望雜合度(He)。觀測(cè)雜合度平均范圍為 0.4195~0.4725, 期望雜合度平均范圍為 0.5700~0.6323, 表明各位點(diǎn)有一定程度的雜合子缺失。在 48個(gè)群體-位點(diǎn)組合中有32個(gè)群體-位點(diǎn)組合顯著偏離平衡(P<0.05), 約占總數(shù) 66.67%。Shannon遺傳多樣性指數(shù)平均值為1.06~1.22。各位點(diǎn)多態(tài)信息含量范圍0.1119~0.8209。

表2 泥蚶4個(gè)群體的遺傳多樣性分析Tab.2 Genetic variability analysis of 4 blood clam T.granosa populations

2.2 遺傳分化

4個(gè)群體間不同位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù) Fst值從0.0347~0.4549, 平均值 0.1930, 相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為遺傳分化程度比較大(處于 0.15~0.25之間); 基因流Nm值為 0.2996~6.9617, 平均值 2.3367; 群體近交系數(shù)Fis范圍0.0052~0.7135, 平均值0.2468, 表明群體的近交程度較高。

續(xù)表

表3 4個(gè)泥蚶群體的基因分化與基因流Tab.3 Gene differentiation and gene flow of 4 blood clam T.granosa populations

3 討論

遺傳育種、保護(hù)種質(zhì)資源等相關(guān)工作能順利開(kāi)展的前提和基礎(chǔ)是維持群體的遺傳多樣性, 群體遺傳多樣性的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。遺傳多樣性降低可導(dǎo)致其適應(yīng)能力降低、有害隱性基因表達(dá)增加及經(jīng)濟(jì)性狀衰退, 最終導(dǎo)致物種退化[18]。因此, 為了保證選育工作的順利進(jìn)行并獲得高質(zhì)量的選育新品種, 保持群體的遺傳多樣性是非常重要的。

3.1 泥蚶群體的遺傳多樣性分析

多態(tài)信息含量、等位基因數(shù)、遺傳多樣性指數(shù)都是體現(xiàn)群體遺傳多樣性的量度參數(shù)。文獻(xiàn)中認(rèn)為PIC>0.5時(shí)為高度多態(tài)性位點(diǎn), 0.25

Shannon遺傳多樣性指數(shù)(Rs)在3個(gè)選育群體中的變化不大, 而與基礎(chǔ)群體相比較略有下降, 在王慶志[15]對(duì)長(zhǎng)牡蠣的報(bào)道中的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果是相似的。說(shuō)明隨著選育的進(jìn)行, 遺傳多樣性指數(shù)趨于穩(wěn)定。3代連續(xù)選育的群體平均有效等位基因數(shù)與基礎(chǔ)群體相比有所下降, 但選育群體之間變化不大, 基本穩(wěn)定。12個(gè)位點(diǎn)PIC平均值: F3、F4、F5代分別為0.5406、0.5251、0.5170; 基礎(chǔ)群體PIC平均值為0.5808。以上結(jié)果表明與基礎(chǔ)群體相比較, 選育的遺傳多樣性雖有一定程度的下降, 但是隨著選育的進(jìn)行, 群體多樣性各指標(biāo)趨于穩(wěn)定。

3.2 泥蚶群體遺傳分化分析

遺傳分化指數(shù)(Fst)反映群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。從本研究的結(jié)果來(lái)看: 4個(gè)群體中12個(gè)位點(diǎn)的Fst值范圍0.0347~0.4549, 平均值為0.1930。表明有19.3%的變異是由群體分化導(dǎo)致的, 而80.7%的變異來(lái)源于群體內(nèi), 群體間的遺傳變異程度處于一般水平。Wright[21]認(rèn)為, 基因流Nm大于1時(shí), 能夠發(fā)揮其均質(zhì)化作用, 從而抑制由遺傳漂變引起的群體間分化。而在本研究中, 12個(gè)位點(diǎn)中有8個(gè)位點(diǎn)的Nm值大于1, 說(shuō)明群體間的交流程度比較高。馬春艷等[22]對(duì)凡納濱對(duì)蝦引進(jìn)群體和 2個(gè)養(yǎng)殖群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析中得到的Fst值為0.0500~0.1657,王學(xué)穎等[16]對(duì)馬氏珠母貝金黃殼色系F3和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)比較研究中得到的Fst值范圍為 0.0031~0.1478, 李云霞等[23]對(duì)刺參群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性研究中的Fst值為0.0130~0.1805,湯健等[24]對(duì)馬氏珠母貝家系遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析中的Fst值 0.0375~0.2733, 這些結(jié)果都比本研究的結(jié)果要低, 產(chǎn)生此差異的原因可能是由于引物設(shè)計(jì)的不同產(chǎn)生結(jié)果差異, 由于引物定位的位置不同,生物群體在該位置發(fā)生不同變異。

本研究結(jié)果表明, 在經(jīng)過(guò)連續(xù)的人工選育過(guò)程,對(duì)群體的遺傳多樣性與基礎(chǔ)群體相比有一定程度的降低, 但仍處于較高水平。這與我們育種選取的方式有關(guān): 因?yàn)椴捎萌后w選育方式確保了有效繁育群體數(shù)量所以遺傳多樣性下降較慢, 但針對(duì)某個(gè)性狀選育的進(jìn)展較慢, 若采用家系選育方式, 雖然就某個(gè)性狀而言選育進(jìn)展較快, 但遺傳多樣性也下降較快。因此, 我們采用群體選育結(jié)合家系選擇的方式, 雖然有一定程度的下降, 但下降程度不顯著。從研究的結(jié)果來(lái)看, 經(jīng)連續(xù)選育的泥蚶群體遺傳分化程度還比較低, 并且其遺傳多樣性和遺傳分化程度逐漸趨于穩(wěn)定。所以, 泥蚶育種仍有非常大的潛力進(jìn)行優(yōu)良性狀的篩選。但今后應(yīng)避免近交繁殖對(duì)選育群體的優(yōu)良性狀產(chǎn)生的不良影響, 確保泥蚶育種工作的持續(xù)健康進(jìn)行。

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