獨活寄生湯對腰椎間盤突出癥小鼠纖維化壞死MMP-1表達的影響

張立莊

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，石家莊 050031)

獨活寄生湯對腰椎間盤突出癥小鼠纖維化壞死MMP-1表達的影響

張立莊

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，石家莊 050031)

目的:旨在觀測腰椎間盤突出癥小鼠灌服獨活寄生湯后體內(nèi)MMP-1含量變化，研究獨活寄生湯對腰椎間盤突出癥患者MMP-1的影響。方法:建立腰椎間盤突出癥小鼠模型，按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、獨活寄生湯組和扶他林組各12只。觀察椎間盤組織形態(tài)學變化，檢測椎間盤局部及血清中MMP-1含量變化。結(jié)果:造模成功后，B組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量較A組顯著增加;灌胃扶他林和獨活寄生湯后，C組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量顯著降低;D組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量亦顯著降低;C組與D組比較，C組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量低于D組小鼠，表明獨活寄生湯治療腰椎間盤突出癥更具療效。結(jié)論:腰椎間盤突出髓核組織和纖維環(huán)組織中MMP-1表達增加，在椎間盤退變突出中發(fā)揮重要作用。獨活寄生湯可有效調(diào)控MMP-1的表達從而發(fā)揮治療作用。

獨活寄生湯;腰椎間盤突出;MMP-1

隨著人口老齡化問題的日漸加劇，腰椎間盤突出癥的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給患者和家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔［1］。腰椎間盤突出癥病程反復，發(fā)病率高［2］。近年來研究顯示，獨活寄生湯是中醫(yī)藥治療本癥的常用方，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液循環(huán)等作用［3］。本研究旨在觀測腰椎間盤突出癥模型小鼠經(jīng)灌服獨活寄生湯后體內(nèi)MMP-1的含量變化，為其臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

MMP-1檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)，高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠，上海)，切片機(MICROM公司，德國)，光學顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 實驗動物

48只健康 C57小鼠，8周齡，體質(zhì)量22.5～24.5 g，雌雄各半。本組研究動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.3 藥物

扶他林(雙氯芬酸鈉緩釋片，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn))，獨活寄生湯超微顆粒組成:獨活12 g，秦艽9 g，桑寄生9 g，牛膝9 g，杜仲9 g，細辛9 g，干地黃6 g，防風6 g，茯苓6 g，當歸6 g，川芎6 g，肉桂心6 g，芍藥6 g，人參6 g，甘草3 g。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 48只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組(A組)、模型組(B組)、獨活寄生湯組(C組)、扶他林組(D組)4組各12只。

1.4.2 造模方法 小鼠稱重、麻醉、固定后，以腰6-7間隙為中心，從左下腹部旁正中切開皮膚，暴露腰L6-7椎體前部位，分開椎前肌肉，采用自制造模器造模。于L6-7椎間隙取45°斜徑位，使用穿刺針刺破前纖維環(huán)及前縱韌帶，再將穿刺針管向右后旋轉(zhuǎn)推進，固定針管，將平頭內(nèi)芯插入針管并推進，將針管內(nèi)的椎間盤組織完全推出到針管外，造成L6-7椎間盤右側(cè)突出模型。

1.4.3 給藥方法 48只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采取標本后分別對各組小鼠進行造模，成功存活1周后開始灌胃。獨活寄生湯組給予灌服獨活寄生湯超微顆粒，劑量為13.8 mg/kg。扶他林組給予灌服伏他林，劑量為2.3 mg/kg。模型組給予灌服等容生理鹽水，每日2次，連續(xù)2周，對照組不予特殊處理。

1.5 指標檢測

1.5.1 血漿標本采集 所有小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉后取材，每只小鼠抽取全血2 ml，經(jīng)3000 rpm/min離心10 min后取上清，－80℃保存待用。

1.5.2 L6-9椎間盤髓核組織標本采集 A組和B組小鼠處死采集局部組織標本，C組和D組小鼠在灌胃2周后處死取材。標本沖洗后分析天平稱重，并按照2 ml/400 mg加入生理鹽水，玻璃勻漿器制成髓核組織勻漿，經(jīng)4000 rpm/min離心10 min后取上清液，－80℃保存待用。

1.5.3 主要觀察指標 ELISA法檢測椎間盤髓核組織和血漿中MMP-1含量，Western blot法檢測MMP-1蛋白表達，HE染色觀察髓核的病理變化情況。

1.6 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)結(jié)果

圖1顯示，造模成功后，腰椎間盤突出癥小鼠髓核中可見新生血管、肉芽組織、纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙，甚至纖維化正常結(jié)構(gòu)消失，髓核出現(xiàn)皺縮，髓核內(nèi)細胞減少。C組和D組小鼠給予獨活寄生湯和扶他林灌胃后，局部炎性細胞浸潤明顯減輕。

圖2顯示，Western blot檢測結(jié)果顯示，MMP-1分子量約為65kDa。4組小鼠MMP-1蛋白檢測可見，造模后MMP-1蛋白表達增加，灌服獨活寄生湯和扶他林后，MMP-1蛋白表達降低。

圖1 免疫組化分析結(jié)果

圖2 Western Blot分析結(jié)果

2.2 突出椎間盤局部MMP-1的含量變化

表1顯示，造模成功后，B組小鼠椎間盤局部組織中MMP-1含量較A組顯著增加，具有統(tǒng)計學意義。灌胃扶他林和獨活寄生湯后，C組小鼠椎間盤局部組織中MMP-1含量顯著降低，D組小鼠椎間盤局部組織中MMP-1含量亦顯著降低。C組與D組比較，C組小鼠椎間盤局部組織中MMP-1含量低于D組小鼠，表明獨活寄生湯治療腰椎間盤突出癥更具療效。

表1 不同組別腰椎間盤突出小鼠椎間盤局部MMP-1含量變化(±s)

表1 不同組別腰椎間盤突出小鼠椎間盤局部MMP-1含量變化(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，表明造模成功;與模型組比較:#P＜0.05;與扶他林組比較:＆P＜0.05

組別 造模成功后 灌服藥物后對 照 組 8.35±2.36 8.17±2.19模 型 組 16.68±4.67* 15.79±4.63獨活寄生湯組 16.42±4.38* 10.11±3.17#＆扶 他 林 組 16.69±4.71* 12.36±3.92#

2.3 外周血漿中MMP-1的含量變化

表2顯示，造模成功后，B組小鼠血漿內(nèi)MMP-1含量較A組顯著增加，具有統(tǒng)計學意義。灌胃扶他林和獨活寄生湯后，C組小鼠血漿內(nèi)MMP-1含量顯著降低，D組小鼠血漿內(nèi)MMP-1含量亦顯著降低。C組與D組比較，C組小鼠血漿內(nèi)MMP-1含量低于D組小鼠，表明獨活寄生湯治療腰椎間盤突出癥更具療效。

表2 不同組別腰椎間盤突出小鼠血漿內(nèi)MMP-1含量變化(±s)

表2 不同組別腰椎間盤突出小鼠血漿內(nèi)MMP-1含量變化(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，表明造模成功;與模型組比較:#P＜0.05;與扶他林組比較:＆P＜0.05

組別 造模成功后 灌服藥物后對 照 組 10.48±2.36 9.67±2.19模 型 組 29.15±4.67* 28.35±4.63獨活寄生湯組 30.14±4.38* 14.11±3.17#＆扶 他 林 組 30.78±4.71* 19.47±3.92#

3 討論

腰椎間盤突出癥屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，多與風、寒、濕、虛相關(guān)，而人體內(nèi)在的正虛是疾病發(fā)病的關(guān)鍵［4-5］。該病以中老年患者為主，因為該人群正是正氣虛衰之際。腰椎間盤突出根據(jù)其臨床表現(xiàn)的不同可分為肝腎虧虛型、風寒濕型、氣滯血瘀型3種類型。寒濕證給予祛濕止痛、溫經(jīng)散寒，血瘀證給予祛瘀通絡(luò)、舒筋活絡(luò)，濕熱證給予祛風利濕、清熱解毒［6-8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，獨活寄生湯為治療本癥的基本方。

獨活寄生湯載于《備急千金要方》，是治療風寒濕痹的重要方藥，具有祛風濕、止痹痛、益肝腎、補氣血藥等功效，主要治療痹癥日久、肝腎兩虛、氣血不足之癥。本方為治療久痹而肝腎兩虛、氣血不足之常用方。方中重用獨活為君藥，善治伏風、除久痹，且性善下行，主要治以祛筋骨以及下焦間的風寒濕邪;細辛、秦艽、防風、桂心入少陰腎經(jīng)作為臣藥，長于風寒濕邪，同時又能夠祛除經(jīng)絡(luò)留濕;桂心溫經(jīng)散寒，具有通利血脈作用;秦艽具有祛風濕、舒筋絡(luò)利關(guān)節(jié)之功效;防風可祛一身之風而勝濕，君藥與臣藥共配伍可驅(qū)風寒濕邪;桑寄生、杜仲、牛膝以補益肝腎而強壯筋骨;川芎、地黃、當歸、白芍可養(yǎng)血和血，茯苓、人參、甘草健脾益氣，與諸藥共用具有益氣血、補肝腎作用。此外，甘草兼使藥共調(diào)和諸藥?？v觀全方，主要為祛風寒濕邪，輔以益氣血與補肝腎之品，邪正兼顧，驅(qū)邪不傷正，扶正不留邪。

近年來研究顯示，獨活寄生湯治療腰椎間盤突出癥的作用機理主要包括免疫抑制、抗炎和改善微循環(huán)。正常椎間盤中未發(fā)現(xiàn)MMP-3、IL-1、IL-1、TNF等免疫反應(yīng)性細胞因子。研究顯示，LDH患者的血清MMP-3含量顯著高于正常人。大量研究還證實，腰椎間盤突出常伴隨炎癥反應(yīng)，其中PGE2被證實是眾多炎癥介質(zhì)中的重要成分。腰椎間盤突出局部組織內(nèi)的PGE2含量顯著高于正常人［9］。椎間盤是脊椎骨的負重關(guān)節(jié)，隨著年齡增長，椎間盤內(nèi)營養(yǎng)成分和水分逐步減少，漸漸發(fā)生退行性變化，進而彈性降低、椎間隙變窄、椎體間過度活動等，從而導致椎間盤突出［10］。

本研究結(jié)果顯示，B組小鼠造模成功后椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量較A組小鼠造模后顯著增加。灌胃扶他林和獨活寄生湯后，C組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量顯著降低，D組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量亦顯著降低。C組與D組比較，C組小鼠椎間盤局部組織和血漿中MMP-1含量低于D組小鼠，表明獨活寄生湯治療腰椎間盤突出癥更具療效。綜上所述，腰椎間盤突出髓核組織和纖維環(huán)組織中MMP-1表達增加，在椎間盤退變突出中發(fā)揮重要作用。獨活寄生湯可有效調(diào)控MMP-1的表達，從而發(fā)揮治療作用。

［1］馬彥旭，張翔，孟開，等．獨活寄生湯治療腰椎間盤突出癥隨機對照試驗的系統(tǒng)評價［J］．中醫(yī)雜志，2012，53(24): 2095-2099．

［2］章良．獨活寄生湯配合針刀針刺治療腰椎間盤突出癥療效觀察［J］．新中醫(yī)，2012，44(11):93-94．

［3］楊彬，李洲進，鄧志，等．獨活寄生湯對腰椎間盤突出癥兔前列腺素 E2的影響［J］．中國組織工程研究，2012，16 (50):9407-9413．

［4］馬彥旭，趙宇昊，黃明華．獨活寄生湯加減治療腰椎間盤突出癥34例［J］．中國實驗方劑學雜志，2011，17(15):241-243．

［5］李俊輝，張向慧，艾進偉，等．獨活寄生湯加減治療腰椎間盤突出癥手術(shù)后遺癥30例［J］．中醫(yī)雜志，2011，52(2): 158-159．

［6］張國福，楊陽，李華南．熱敏灸療配合中藥內(nèi)服治療風寒濕型腰椎間盤突出癥［J］．中國實驗方劑學雜志，2012，18 (7):264-266．

［7］王煜，朱文勇，張振華．60例腰椎間盤突出癥患者術(shù)后MRI檢查結(jié)果分析［J］．山東醫(yī)藥，2010，50(18):74-75．

［8］王洪偉，李長青，周躍．腰椎間盤突出癥疼痛發(fā)生機制的研究進展［J］．中國矯形外科雜志，2011，19(7):568-571．

［9］張志南．傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療方法對腰椎間盤突出癥的臨床癥狀改善分析［J］．時珍國醫(yī)國藥，2013，24(8):1923-1925．

［10］劉曉虹，汪珍秀．中藥聯(lián)合手法治療腰椎間盤突出癥46例療效觀察［J］．新中醫(yī)，2013，45(7):153-154．

R285．5

B

1006-3250(2015) 02-0172-03

2014-11-16

張立莊(1980-)，男，醫(yī)學本科，從事中西醫(yī)結(jié)合防治脊柱病的臨床與研究。