益氣養(yǎng)陰利水劑對(duì)脾氣虛型視網(wǎng)膜脫離復(fù)位后抗凋亡及抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究*

張妍春，雷春靈，楊新光，畢春潮，孫娟玲，郭 艷，朱賽林，李亞芙

(1．西安市第四醫(yī)院，西安 710004;2．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712000)

益氣養(yǎng)陰利水劑對(duì)脾氣虛型視網(wǎng)膜脫離復(fù)位后抗凋亡及抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究*

張妍春1，雷春靈1，楊新光1，畢春潮1，孫娟玲1，郭 艷2，朱賽林1，李亞芙1

(1．西安市第四醫(yī)院，西安 710004;2．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712000)

目的:觀察益視湯對(duì)脾氣虛型兔RD自動(dòng)復(fù)位后細(xì)胞凋亡及機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。方法:實(shí)驗(yàn)兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(A)、RD自動(dòng)復(fù)位組(B)、脾氣虛型RD自動(dòng)復(fù)位組(C)及益視湯治療組(D)，分別于RD自動(dòng)復(fù)位模型制備后10 d、20 d、30 d隨機(jī)處死取材，采用透射電鏡及TUNEL染色觀察視網(wǎng)膜各層細(xì)胞凋亡的發(fā)生，取血清行SOD、MDA測(cè)定。結(jié)果:電鏡下可見B、C、D組視網(wǎng)膜內(nèi)外核層出現(xiàn)凋亡特征性形態(tài)改變細(xì)胞及TUNEL染色陽性細(xì)胞，比較細(xì)胞凋亡指數(shù)，C組較B組明顯升高;D組較C組顯著下降。與A、B組比較，C組血清SOD活性明顯降低，MDA值明顯升高，D組較C組SOD活性顯著升高，MDA降低。結(jié)論:脾氣虛證加重機(jī)體氧化損傷及RD自動(dòng)復(fù)位后細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使用益視湯能夠提高機(jī)體的抗氧化能力，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

脾氣虛證;視網(wǎng)膜脫離;益氣養(yǎng)陰利水;細(xì)胞凋亡;氧化應(yīng)激;益視湯

視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)是嚴(yán)重的致盲性眼病，隨著RD手術(shù)復(fù)位率的不斷提高［1-3］，術(shù)后大多數(shù)患者即使視網(wǎng)膜解剖復(fù)位良好但視功能改善不理想，長期隨訪RD涉及黃斑的患者術(shù)后視力多年多數(shù)僅維持在0.2～0.4之間［4-6］，目前臨床缺乏有效的藥物促進(jìn)患者術(shù)后視功能的恢復(fù)，由此帶來的問題尤顯突出。除神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成等視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞外，感光細(xì)胞的凋亡是RD患者視力喪失的主要原因［7-9］。近年來的研究已證實(shí)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［10］。許多誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的因子本身就是氧化劑或者是刺激細(xì)胞發(fā)生氧化代謝的因子，而大量凋亡抑制劑能夠抗氧化或提高細(xì)胞抗氧化能力［11］。

多年來，中醫(yī)藥臨床廣泛用于RD的輔助治療。脾氣虛證與RD關(guān)系密切，患者氣虛不固導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與色素上皮層間分離，脾虛失運(yùn)致視網(wǎng)膜下液蓄積且吸收困難，久病傷陰進(jìn)一步加重視功能損傷。根據(jù)這一病理機(jī)制，我們制定了以補(bǔ)益脾氣為主、利水養(yǎng)陰為輔的中藥復(fù)方制劑“益視湯”，促進(jìn)RD復(fù)位手術(shù)后視網(wǎng)膜下液的吸收及視功能的恢復(fù)，取得了肯定的效果。

脾胃為后天之本，生化之源，細(xì)胞內(nèi)ATP合成不足是脾氣虛證發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制之一［12］。線粒體是細(xì)胞內(nèi)合成ATP的主要場(chǎng)所，前期實(shí)驗(yàn)觀察到與單純RD自動(dòng)復(fù)位組比較，脾氣虛型RD自動(dòng)復(fù)位后，光感受器內(nèi)節(jié)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等部位均有顯著的線粒體腫脹、嵴減少甚至消失、膜破損或變性溶解形成空白區(qū)的表現(xiàn)［13-14］，同時(shí)脾氣虛證能加重細(xì)胞核固縮和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;使用益視湯能夠明顯減輕線粒體的損傷及細(xì)胞核固縮現(xiàn)象［15-16］。在病理情況下，線粒體是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所［17-18］，視網(wǎng)膜有大量的線粒體，是需要高有氧代謝的組織。由此我們推測(cè)，脾氣虛證加重視網(wǎng)膜脫離復(fù)位后線粒體損傷，致ATP合成不足及氧化損傷，加重視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而影響視功能的恢復(fù)，益視湯能改善脾氣虛型RD機(jī)體的抗氧化能力，降低RD復(fù)位后細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康成年清潔級(jí)新西蘭灰兔40只，體質(zhì)量2000 g～2500 g，雌雄不拘，經(jīng)裂隙燈、直接檢眼鏡檢查眼前節(jié)及眼底均無異常，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)室均由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將40只實(shí)驗(yàn)兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為A組正常對(duì)照組(4只)、B組RD自動(dòng)復(fù)位組(12只)、C組脾氣虛型RD自動(dòng)復(fù)位組(12只)、D組益視湯治療組(12只)4組，在制備RD自動(dòng)復(fù)位模型后按先前的方法每日灌服益視湯［16］。B、C、D組分別在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)建立RD自動(dòng)復(fù)位模型，手術(shù)前、手術(shù)后10 d、20 d、30 d各組抽取靜脈血，在手術(shù)后10 d、20 d、30 d隨機(jī)處死4只取材進(jìn)行檢查。

1.2 造模方法

1.2.1 脾氣虛動(dòng)物模型的制備 與先前的實(shí)驗(yàn)相同，使用耗氣破氣加饑飽失常方法制備脾氣虛證動(dòng)物模型［14］。于實(shí)驗(yàn)開始后將厚樸三物湯煎劑經(jīng)胃管灌喂C、D組兔，每2 d灌胃1次，用藥量12 g/kg體質(zhì)量，喂藥當(dāng)日禁食，次日喂飼不限量;A、B組同時(shí)給予等體積生理鹽水灌胃，正常飲食及飲水量，共持續(xù)42 d造模。

1.2.2 RD自動(dòng)復(fù)位動(dòng)物模型的制備 使用先前的方法在視網(wǎng)膜下注射透明質(zhì)酸鈉，于脾氣虛證模型造模開始后第22天制備RD自動(dòng)復(fù)位模型［14］。術(shù)前對(duì)B、C、D組兔用0.5%復(fù)方托品酰胺眼水(日本參天株式會(huì)社)散瞳，5號(hào)球后針自顳上方角鞏緣后3mm處刺穿鞏膜進(jìn)入玻璃體，放置中斜角膜接觸鏡，鼻下方視網(wǎng)膜近赤道部造1～2PD裂孔后向視網(wǎng)膜下緩慢推注透明質(zhì)酸鈉，使后極部視網(wǎng)膜灰白色隆起范圍逐漸擴(kuò)大。

1.3 觀察指標(biāo)及測(cè)試方法

1.3.1 宏觀指標(biāo)及血清D-木糖檢測(cè) 清晨未喂食前檢查各組實(shí)驗(yàn)兔的精神、活動(dòng)度、舌象、體質(zhì)量、肛溫，每周1次，每7 d總食量平均后記為各組實(shí)驗(yàn)兔每天食量。分別在手術(shù)前、手術(shù)后10、20、30 d清晨將10%D-木糖按0.5 g/kg給各組兔灌胃，2 h后自耳源靜脈抽取靜脈血約3 ml，3500 rpm離心10 min后制備血清，采用間苯三酚法測(cè)定血清D-木糖(南京建成生物工程研究所D-木糖測(cè)定試劑盒，具體操作方法遵照說明書進(jìn)行)。計(jì)算方法:血清D－木糖值(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)濃度×(測(cè)定管OD值－測(cè)定空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值－試劑空白管OD值)×樣品稀釋比例。

1.3.2 眼底檢查 術(shù)后每天使用直接檢眼鏡、眼部B超、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)觀察眼底至視網(wǎng)膜自動(dòng)復(fù)位，記錄RD的范圍、裂孔大小、自動(dòng)復(fù)位時(shí)間、視網(wǎng)膜出血情況和玻璃體反應(yīng)等情況。

1.3.3 血清T-SOD和MDA檢測(cè) 分別在實(shí)驗(yàn)開始、手術(shù)前、手術(shù)后10 d、20 d、30 d抽取靜脈血離心制備血清，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清總超氧化物歧化酶(SOD)，采用硫代巴比妥(TBA)法測(cè)定血清丙二醛(MDA)。測(cè)試盒購于南京建成生物工程研究所，具體操作依照說明書要求，722分光光度計(jì)分別在550 nm、532 nm處、1 cm光徑測(cè)各管吸光度值。

1.3.4 電鏡樣品及TUNEL染色標(biāo)本制作與觀察 A組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，B、C、D組在手術(shù)后10 d、20 d、30 d，耳緣靜脈注射過量的3%戊巴比妥鈉分批處死實(shí)驗(yàn)兔，即刻摘取眼球，快速全周剪除角膜，將左眼置于2.5%戊二醛固定液中，右眼置于4%多聚甲醛中，4℃固定24 h，按先前的方法制備透射電鏡超薄切片，使用日本日立H-600透射式電子顯微鏡進(jìn)行觀察拍照［14］;右眼切取顳下方發(fā)生過RD并已復(fù)位區(qū)域的視網(wǎng)膜組織，按原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)說明進(jìn)行操作。具體為:常規(guī)冰凍視網(wǎng)膜組織，用切片機(jī)連續(xù)切成厚4 μm切片3張，分別貼于載玻片上，PBS洗片，0.3%H2O2甲醇室溫孵育30 min，PBS洗片，0.1% TritonX-100冰浴中孵育2 min，PBS沖洗，滴加50 μlTUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗3次;加入50 μl轉(zhuǎn)化劑-POD在濕盒中37℃孵育 30 min，PBS沖洗 3次;加入 50～100 μlDAB底物，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次;蘇木素復(fù)染，PBS沖洗3次，樹膠加蓋片封固;陰性對(duì)照:冰凍切片通透后加入50 μl標(biāo)記溶液以代替TUNEL反應(yīng)混合物，其余步驟同前。BX-50 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)下分析結(jié)果并拍照。以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為TUNEL陽性標(biāo)記細(xì)胞。高倍鏡下(×40)對(duì)每張切片取5個(gè)視野，每組共20個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，其中外核層細(xì)胞數(shù)目較多，使用0.5網(wǎng)形目鏡尺(5 mm×5 mm，各分為10等份，上海第三光學(xué)儀器廠)，分別記數(shù)2.5 mm2范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)，以凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，A I)反映視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的情況，A I=(記數(shù)范圍內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，多組間比較采用多因素方差分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05、P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宏觀指標(biāo)及血清D-木糖檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)開始后1周，C、D組兔出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮嗜臥、納食減少、稀軟便、毛色枯黃等脾氣虛證一般癥狀體征，10 d后出現(xiàn)耳尾色白、體溫升高、舌質(zhì)淡嫩、少苔等表現(xiàn)。停止脾氣虛造模因素后觀察到，該組兔軟便持續(xù)存在、毛色灰白、精神倦怠等脾氣虛證一般癥狀體征持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。各組實(shí)驗(yàn)開始體質(zhì)量均數(shù)(2.2±0.13)至(2.27±0.16)之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)過程中，A、B組不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、A、B組間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)前及術(shù)后10 d、20 d、30 d C組及D組體質(zhì)量明顯降低，與A、B組比較差距顯著(P＜0.01);隨時(shí)間延長D組體質(zhì)量有所恢復(fù)，至術(shù)后20 d、30 d與C組比較明顯升高(P＜0.05)，但仍與B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組間血清D-木糖值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)過程中A、B組不同時(shí)間點(diǎn)血清D-木糖值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)前C、D組兔血清D-木糖值較A、B組明顯降低，術(shù)后C組兔仍維持在較低水平，停止造脾氣虛模型因素干預(yù)后稍有恢復(fù)，但仍顯著低于A、B組(P＜0.001);D組兔灌服益視湯后血清D-木糖值緩慢升高，至術(shù)后30 d接近正常對(duì)照組(P＞0.05)。圖1顯示，各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)期體質(zhì)量及血清D-木糖值變化。

圖1 不同時(shí)間各組平均體質(zhì)量(kg)及血清D-木糖水平(mmol/l)

2.2 眼部檢查情況

術(shù)時(shí)在顯微鏡下均可見視盤下方視網(wǎng)膜灰白色隆起范圍達(dá)50%～60%。術(shù)后裂隙燈下觀察，所有眼角膜透明，前房無異常反應(yīng)，晶狀體透明，2只眼玻璃體內(nèi)可見少量絮狀混濁。直接檢眼鏡觀察示，術(shù)后早期鼻下方近赤道部約1～2PD裂孔，隨復(fù)位時(shí)間延長視網(wǎng)膜脫離范圍逐漸縮小并自行復(fù)位，裂孔處瘢痕灶形成;B超、OCT檢查示，術(shù)后神經(jīng)上皮層與色素上皮層間發(fā)生漿液性脫離(見圖2)，視網(wǎng)膜下液量隨術(shù)后時(shí)間延長逐漸減少并完全吸收。其中B、C、D組兔RD分別維持(7.38±2.55)d、(7.54 ±2.21)d、(7.26±2.23)d，經(jīng)方差分析各組自動(dòng)復(fù)位時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 B超及OCT檢查

圖3 各組不同時(shí)間血清SOD活性、MDA水平比較

2.3 血清SOD和MDA檢測(cè)結(jié)果

圖3顯示，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)檢查見各組血清SOD活性及MDA值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RD對(duì)照組與正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)前C、D組與A、B組比較，SOD活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，MDA值明顯升高(P＜0.01);術(shù)后20 d、30 d C組比較，A、B組SOD活性明顯下降(P＜0.01)，MDA值明顯升高(P＜0.05)，D組較C組SOD活性明顯升高(P＜0.05)，MDA值降低(P＜0.001)。

2.4 凋亡細(xì)胞觀察

2.4.1 透射電鏡觀察 圖4顯示，透射電鏡下，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜視細(xì)胞、雙極細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及高爾基體等結(jié)構(gòu)清晰;B、C、D組視網(wǎng)膜內(nèi)核層、外核層均可觀察到有散在細(xì)胞體積變小、胞質(zhì)密度增高、核染色質(zhì)致密固縮，且出現(xiàn)形狀不一、大小不等的團(tuán)塊散布于核內(nèi)或邊集于核膜下，有的核染色質(zhì)致密凝聚成塊，占據(jù)整個(gè)核區(qū)并出現(xiàn)核周空泡，而核膜、質(zhì)膜和細(xì)胞器保存完好。

2.4.2 TUNEL染色結(jié)果 圖5顯示，觀察見正常對(duì)照組很少有被標(biāo)記的細(xì)胞，陰性對(duì)照組無被標(biāo)記細(xì)胞，B、C、D組均可見細(xì)胞核被標(biāo)記為黃棕色的細(xì)胞分散分布于內(nèi)外核層，細(xì)胞核被環(huán)形或均勻一致著色，周圍未見明顯炎癥反應(yīng)。

分別計(jì)算B、C、D組術(shù)后各層凋亡指數(shù)均值可以發(fā)現(xiàn)，外、內(nèi)核層凋亡指數(shù)明顯高于節(jié)細(xì)胞層(P＜0.001)，B、C組內(nèi)外核層凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組內(nèi)核層凋亡指數(shù)較外核層明顯下降(P＜0.001)(圖6-A);比較術(shù)后不同時(shí)間各組差異發(fā)現(xiàn)，術(shù)后10 dC組外核層、內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞凋亡指數(shù)均較B組升高(P＜0.05)。結(jié)果表明，脾氣虛證增加了RD復(fù)位后早期各層視網(wǎng)膜的凋亡細(xì)胞比例，至20 d、30 d時(shí)鏡下計(jì)數(shù)單位面積凋亡細(xì)胞數(shù)值及總細(xì)胞數(shù)量均明顯高于RD對(duì)照組(P＜0.01)，凋亡指數(shù)與RD對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析B組單位面積細(xì)胞總數(shù)較A組增多與Müller細(xì)胞異常增生有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。經(jīng)益視湯治療后凋亡細(xì)胞發(fā)生率明顯下降，早期內(nèi)外核層及節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞凋亡指數(shù)D組較C組均明顯下降(P＜0.05)，術(shù)后20 d、30 d內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層D組較C組凋亡指數(shù)明顯降低(P＜0.05) (圖6-B、C、D)。提示益視湯可以減慢但并未阻止視網(wǎng)膜脫離復(fù)位后細(xì)胞凋亡的發(fā)生，尤其隨病程延長對(duì)內(nèi)核層及節(jié)細(xì)胞層的保護(hù)作用明顯。

圖4 透射電鏡下觀察內(nèi)核層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征性改變(Bar=4 μm)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用耗氣破氣加饑飽失常的多因素復(fù)合應(yīng)用制備脾氣虛證動(dòng)物模型［19］，其造模時(shí)間相對(duì)較長，同時(shí)模型表現(xiàn)較為穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)過程中觀察到，脾氣虛證一般宏觀癥狀體征在造模干預(yù)后1周就開始有所表現(xiàn)，術(shù)前監(jiān)測(cè)制備脾氣虛證模型組體質(zhì)量及血清D-木糖值均明顯下降，低于對(duì)照組，停止脾氣虛模型造模干預(yù)因素后，脾氣虛組兔以上表現(xiàn)仍然持續(xù)存在直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;在此基礎(chǔ)上采用視網(wǎng)膜下直接注射透明質(zhì)酸鈉［20］造成視網(wǎng)膜脫離，經(jīng)4～10 d后視網(wǎng)膜全部自行復(fù)位，避免了其他復(fù)位干預(yù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

圖5 術(shù)后30 d光鏡下視網(wǎng)膜冰凍切片TUNEL染色(40x)

圖6 各組視網(wǎng)膜三級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞層細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活依賴于氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡。在生理情況下，內(nèi)源性活性氧在線粒體內(nèi)發(fā)生的電子傳遞反應(yīng)中產(chǎn)生，被細(xì)胞防御體系(包括非酶類及酶類，前者如左旋維生素C、維生素E、谷胱甘肽，后者如超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等)清除。但是在特殊的病理情況下，活性氧生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，引起細(xì)胞的氧化損傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［21］。實(shí)驗(yàn)中觀察到，脾氣虛組血清MDA升高明顯，表明脾氣虛證這一病理狀態(tài)加重了機(jī)體的脂質(zhì)過氧化損傷。血清SOD在術(shù)后10 d仍保持在較高水平，到術(shù)后20 d明顯降低。這可能是由于造模前期干預(yù)時(shí)間較短，兔機(jī)體自我調(diào)節(jié)能力尚存，通過提高自身的抗氧化能力來清除累積的ROS，但處于失代償狀態(tài)，隨著造模時(shí)間的延長，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)缺陷，組織氧化-抗氧化平衡進(jìn)一步失調(diào)，致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。

過多的ROS會(huì)損傷細(xì)胞大分子，并參與不同的細(xì)胞凋亡通路，如已經(jīng)明確的誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)變、釋放線粒體死亡放大因子、激活細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以及破壞DNA等［22］導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道，視網(wǎng)膜脫離后感光細(xì)胞發(fā)生凋亡是視網(wǎng)膜脫離后發(fā)生不可逆視功能損傷的重要原因［7-8］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象在視網(wǎng)膜脫離發(fā)生后外核層和內(nèi)核層均有典型表現(xiàn)。TUNEL染色顯示，被標(biāo)記的細(xì)胞呈分散分布于內(nèi)外核層及節(jié)細(xì)胞層，細(xì)胞核被環(huán)形或均勻一致著色，反映了凋亡過程中核染色質(zhì)先向核邊緣遷移、而后向中央集中的特點(diǎn);同時(shí)發(fā)現(xiàn)被TUNEL標(biāo)記的感光細(xì)胞周圍缺乏炎癥反應(yīng)，從另一個(gè)側(cè)面支持視網(wǎng)膜細(xì)胞的主要死亡形式是凋亡。以上結(jié)果證實(shí)，RD復(fù)位后視網(wǎng)膜視細(xì)胞及雙極細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞均有凋亡，且凋亡發(fā)生以內(nèi)外核層為主，節(jié)細(xì)胞層亦有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡，這在國內(nèi)尚未見報(bào)道，而脾氣虛證加重了RD復(fù)位后視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的凋亡。

益視湯是在前人用藥基礎(chǔ)上結(jié)合RD復(fù)位后病理改變及現(xiàn)代中藥藥理研究結(jié)果自行組方的中藥湯劑，全方由9味藥物組成，以具有補(bǔ)氣固脫作用的人參、黃芪作為君藥，以車前子等利水藥作為臣藥，以補(bǔ)肝腎、養(yǎng)陰血的枸杞等作為佐藥，以茺蔚子作為使藥直達(dá)目系，全方共奏補(bǔ)氣利水養(yǎng)陰的作用。研究結(jié)果表明，益視湯能夠提高實(shí)驗(yàn)兔血清抗氧化能力，減輕脾氣虛證加劇的機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷，進(jìn)而降低視神經(jīng)細(xì)胞丟失?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果也表明，組方中含有的人參皂甙Rg1具有清除自由基、抗氧化作用及阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長作用，黃芪、枸杞子有促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞增殖等作用，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

以上結(jié)果表明，脾氣虛證加重了機(jī)體氧化損傷及視網(wǎng)膜脫離復(fù)位后內(nèi)外核層及節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞凋亡的發(fā)生，采用具有益氣養(yǎng)陰利水作用的中藥經(jīng)驗(yàn)方益視湯經(jīng)胃管灌服進(jìn)行治療，能夠提高機(jī)體的抗氧化能力，降低因細(xì)胞丟失而導(dǎo)致的嚴(yán)重視功能喪失。

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Experimental study of Yiqi Yangyin diuretic prescription on the anti apoptosis and antioxidant function of the spleen deficiency type after retinal detachment

ZHANG Yan-chun1，LEI Chun-ling1，YANG Xin-guang1，BI Chun-chao1，Sun Juan-ling1，GUO Yan2，ZHU Sai-lin1，LI Ya-fu1
(1.The 4th Hospital of Xi'an，Xi'an 710004，China;2．Shaanxi traditional Chinese medical university，Xianyang 712000，China)

Objective:To investigate the influence of Chinese medicinal decoction with tonifying qi and yin and diuresis on retinal apoptosis in reattached retina of deficiency of spleen-qi rabbit model．Method:42 pigment rabbits were randomly divided into normal control group(A)，RD automatically reattachment group(B)，and RD automatically reattachment with deficiency of spleen-qi group(C)and Chinese medicinal decoction treatment group(D)．Then the reattachment retinal apoptosis were detected with TUNEL staining and electron microscopy in postoperative 10 d，20 d，and 30 d．SOD activities and MDA levels of blood serum were also checked．Result:The morphological features of apoptosis，such as nuclear chromatin condensation and fragmentation as well as cell shrinkage presented in the ONL and INL of B，C and D groups．The results of TUNEL staining revealed the positive cells presented in not only ONL but also INL and NFL in the reattached retina，and apoptotic indexes of C groups increased obviously in 10 d post operation．Compared with A and B groups，the activities of serum SOD decreased and the content of MDA increased．The Chinese medicinal decoction could obviously inhibit the occurrence of retinal apoptosis at any time points，enhanced serum SOD activities and reduced the levels of serum MDA．Conclusion:Our results suggest that the pathology spleen-qi syndrome increase oxidative stress damage and aggravate the retinal apoptosis in retina reattachment．The Chinese medicinal decoction with tonifying qi and yin and diuresis is a potent neuroprotective agent that can salvage retinal neurons in rabbits with retinal reattachment and elevate the ability of antioxidation．

Deficiency of spleen-qi;Retinal detachment;Tonifying qi and yin and diuresis;Apoptosis;Oxidative stress

R774

B

1006-3250(2015)02-0153-06

2014-11-11

西安市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(GG05138)

張妍春(1974-)，女，陜西人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事玻璃體視網(wǎng)膜疾病及中西醫(yī)結(jié)合眼科的臨床與研究。