CAG的中醫(yī)證型與幽門螺旋桿菌、IL-10的相關(guān)性研究*

劉長明，馮全林，張劍治，胡漪璐，楊 悌，張 穎

(南京中醫(yī)藥大學(xué)昆山附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇昆山 215300)

CAG的中醫(yī)證型與幽門螺旋桿菌、IL-10的相關(guān)性研究*

劉長明，馮全林，張劍治，胡漪璐，楊 悌，張 穎△

(南京中醫(yī)藥大學(xué)昆山附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇昆山 215300)

目的:探討慢性萎縮性胃炎(CAG)患者的證型與幽門螺旋桿菌(Hp)感染、IL-10的基因多態(tài)性及水平的相關(guān)性。方法:招募156例CAG患者及150名無Hp感染的健康人，采用C13呼氣法及金標(biāo)法檢測Hp、ELISA檢測IL-10含量、PCR-RFLP分析IL-10多態(tài)性。結(jié)果:CAG患者證型以脾胃虛弱(35.44%)與胃陰不足(27.22%)為主。CAG患者Hp的感染率為49.37%，以脾胃濕熱(69.23%)、肝胃不和(68.42%)及瘀血阻絡(luò)組(57.14%)較高，與其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。脾胃濕熱組(55.57± 12.31pg/ml)及肝胃不和組IL-10水平(48.38±13.91pg/ml)顯著高于對照組(38.21±5.35 pg/ml)。IL-10基因多態(tài)性在病例及對照組之間分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:Hp感染與CAG患者外周血的IL-10水平相關(guān)，二者均與CAG證型相關(guān)，提示中醫(yī)治療CAG時應(yīng)關(guān)注患者的Hp感染及患者的IL-10水平。

慢性萎縮性胃炎;證型;Hp感染;IL-10;基因多態(tài)性

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis， CAG)是由多種因素導(dǎo)致的胃黏膜反復(fù)損傷引起的胃黏膜上皮和腺體萎縮的消化系疾病，因其多伴有腸上皮化生和不典型增生而與胃癌發(fā)生關(guān)系密切［1］。CAG的病因尚不明確，現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染、患者的免疫反應(yīng)及遺傳因素是其主要致病因素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療CAG往往療效欠佳，而中醫(yī)對CAG進行辨證施治獲得良好治療效果。研究顯示，CAG的中醫(yī)證型與Hp感染相關(guān)［2-3］，然而對Hp感染后患者的免疫狀態(tài)及遺傳背景鮮有報道。白細胞介素10(IL-10)是重要的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，處于機體免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)。本研究擬采用分子生物學(xué)、免疫學(xué)的方法分析患者的IL-10基因多態(tài)性及Hp感染，探討其與CAG中醫(yī)證型的關(guān)系，為中醫(yī)治療CAG提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

招募來自2012年1月至2013年12月期間因胃部不適來昆山市中醫(yī)醫(yī)院就診并經(jīng)病理確認(rèn)為CAG患者共計156例。其中男性93例，女性63例，平均年齡(51±15.23)歲。招募體檢正常者150例，平均年齡(52±16.35)歲，其中年齡、性別與CAG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組經(jīng)C13呼氣實驗及金標(biāo)法檢驗確認(rèn)無Hp感染。所有病例經(jīng)脾胃病科診斷并辨證分型(脾胃虛弱、肝胃不和、脾胃濕熱、胃陰不足、瘀血阻絡(luò)［3-4］)。

1.2 試劑

C13呼氣實驗試劑盒為Isodiagnostika公司產(chǎn)品;金標(biāo)法檢測血清Hp抗體試劑盒為北京康美天鴻生物科技有限公司產(chǎn)品;IL-10 ELISA檢測試劑盒為上海森雄科技實業(yè)有限公司產(chǎn)品。DNA提取試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品;RNA酶及蛋白酶K購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA聚合酶由大連Takara公司提供;限制性內(nèi)切酶RsaⅠ及SspⅠ均為Fermentas Life Sciences公司產(chǎn)品;BslⅠ為NEB公司產(chǎn)品;PCR擴增所用引物由上海Invitrogen有限公司合成。

1.3 Hp感染檢測

患者及正常對照組經(jīng)C13呼氣實驗及金標(biāo)法檢測Hp感染，二者同時確認(rèn)為Hp感染陽性。正常對照組經(jīng)C13呼氣實驗及金標(biāo)法檢測，同時為陰性者納入本研究。試驗步驟均依說明書按步驟完成。

1.4 IL-10血漿含量檢測

采集患者及健康受試者全血分離血漿。采用ELISA法對患者及健康受試者血漿中的IL-10含量進行檢測，實驗操作步驟依據(jù)產(chǎn)品說明書進行。

1.5 CAG診斷及中醫(yī)辨證分型

臨床患者行胃鏡活檢，經(jīng)病理診斷為CAG的患者接受中醫(yī)治療，由脾胃病科中醫(yī)醫(yī)師依臨床診斷進行中醫(yī)辨證分型。

1.6 基因組DNA提取及IL-10基因分型

1.6.1 DNA提取 取EDTA-K2抗凝全血，分離血漿后加入3 ml紅細胞裂解液，混勻震蕩5 min，800 g離心5 min沉淀白細胞;然后進行白細胞基因組DNA提取，實驗步驟依照試劑盒說明書進行。

1.6.2 IL-10基因分型 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)分析IL-10(IL-10-1082、-819及-592位點)的基因多態(tài)性。經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)物分別用BslⅠ(IL-10-1082)、SspⅠ(IL-10-819)及RsaⅠ(IL-10-592)限制性內(nèi)切酶進行酶切，酶切的方法同先前發(fā)表的論文［5］，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分型。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用χ2檢驗，并通過比數(shù)比(OR)進行相關(guān)性分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗統(tǒng)計差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAG患者的中醫(yī)證候分型

表2顯示，患者以脾胃虛弱(56例，35.44%)與胃陰不足(43例，27.22%)較多，其他證型的例數(shù)排序分別為脾胃濕熱、肝胃不和、瘀血阻絡(luò)。

表1 PCR-RFLP法分析IL-10啟動子區(qū)基因多態(tài)性

2.2 CAG患者Hp感染情況

CAG患者中有76例(49.37%)檢出Hp感染，以脾胃濕熱組(69.23%)、肝胃不和組(68.42%)及瘀血阻絡(luò)組(57.14%)感染率較高。脾胃濕熱組Hp感染率最高，與脾胃虛弱組(χ2=7.17，P= 0.007)及胃陰不足組(χ2=4.86，P=0.027)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;肝胃不和組的Hp感染率其次，顯著高于脾胃虛弱組(χ2=5.47，P=0.019)，其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 正常對照組及CAG患者組血清IL-10含量

表3顯示，正常對照組外周血中IL-10濃度顯著低于脾胃濕熱組及肝胃不和組(P＜0.05)，其余各組亦均比正常對照組高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 CAG患者及正常對照組IL-10基因多態(tài)性分析

表4顯示，正常對照組3個位點的基因型分布頻率符合哈溫-伯格平衡，具有群體代表性。3個基因多態(tài)性位點的基因型分布頻率在2組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與野生基因型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 CAG患者中醫(yī)辨證分型及Hp感染情況［例(%)］

表3 正常對照組及CAG患者組血清IL-10含量比較(±s)

表3 正常對照組及CAG患者組血清IL-10含量比較(±s)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05;與CAG Hp未感染組比較:#P＜0.05

?

表4 IL-10各基因型分布與CAG相對風(fēng)險分析［例(%)］

3 討論

CAG被普遍認(rèn)為是胃癌的癌前病變，周阿高等［6］對近10年來文獻總結(jié)顯示，中醫(yī)治療CAG療效較好。本研究結(jié)果顯示，CAG證型以脾胃虛弱與胃陰不足為主，其中脾胃濕熱、肝胃不和證型患者中的Hp感染率相對較高，且IL-10呈現(xiàn)較高水平。然而IL-10啟動子區(qū)基因多態(tài)性在對照組及CAG組分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究觀測到CAG以脾胃虛弱證型為多，與丁成華等報道一致［4］。本研究各證型的排序與魏玉霞的分析結(jié)果相一致［7］。該研究顯示，證型占比順序依次為脾胃氣虛、胃陰虧虛、脾胃濕熱、肝胃不和、脾胃虛寒、肝郁脾虛、瘀阻胃絡(luò)、氣陰兩虛。Hp菌體表面的脂多糖、脲素酶及細胞毒素是引起患者免疫反應(yīng)的主要因素，Hp感染引起的患者免疫反應(yīng)與胃部疾病的進展相關(guān)［8］。中醫(yī)治療CAG以辨證論治為主，但仍然強調(diào)“審癥求因”。一般說來，Hp屬于中醫(yī)學(xué)“邪氣”、“熱毒”范疇。外感邪氣經(jīng)口侵入體內(nèi)，犯于脾胃，脾胃功能失常，引起胃脘部脹悶、疼痛、納差等。外邪侵入機體后易于化熱，因此本病患者多有胃熱表現(xiàn)。另一方面，“正氣存內(nèi)，邪不可干”、“邪之所湊，其氣必虛”。脾胃虧虛是Hp能侵入體內(nèi)引起疾病的前提之一，且CAG病程一般較長，日久則正氣漸虛而致脾胃虛弱。Hp感染與CAG患者證型的因果關(guān)系較為復(fù)雜。本研究對156例患者觀察顯示，Hp感染率為49.37%，在各證型中分布依次為脾胃濕熱、肝胃不和、瘀血阻絡(luò)、胃陰不足、脾胃虛弱。此與劉興山等［9］對287例CAG患者研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染與CAG證型分布(胃絡(luò)瘀血＞脾胃濕熱＞肝胃不和＞脾胃虛弱＞胃陰不足)結(jié)果相近。但該研究報道，Hp的總體感染率為69.34%，可能因Hp感染率地區(qū)差異所致。此外，王立等［10］對1366例Hp感染胃部疾病患者中證型依次為脾胃濕熱型＞胃絡(luò)瘀血型＞肝胃不和型＞脾胃虛弱型;陳飛松等［11］報道，Hp感染患者證型依次為脾胃濕熱＞肝胃不和＞脾胃虛弱＞胃陰不足。雖上述研究并非針對CAG患者，但與本研究的結(jié)果相近。上述研究的證型分布除地區(qū)間Hp感染率差異外，近年來因經(jīng)濟條件改善、患者積極治療亦是重要原因。

IL-10是由輔助性T細胞亞群Th2細胞分泌的一種抑制Th1細胞功能、抑制炎癥的細胞因子，其處于免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，具有免疫抑制和免疫刺激的雙向作用［12］。本研究顯示，在CAG患者中IL-10呈現(xiàn)升高的趨勢，以脾胃濕熱組及肝胃不和組為主。此外本研究還顯示，CAG患者并發(fā)Hp感染較未感染患者的IL-10更高，與張洪芳等的報道相一致［13］。但IL-10的表達與中醫(yī)CAG證型的相關(guān)性迄今未見報道，本研究的結(jié)果提示IL-10與Hp感染及患者的證型相關(guān)。

近年來研究顯示，IL-10基因啟動子的基因多態(tài)性與IL-10的表達相關(guān)，且與胃部疾病的發(fā)生相關(guān)。課題組前期研究顯示，IL-10啟動子區(qū)IL-10-1082位點的GA基因型與胃癌的發(fā)生相關(guān)［5］。但本研究結(jié)果顯示，IL-10基因啟動子區(qū)多態(tài)性與CAG無相關(guān)性，此結(jié)果國外的研究中亦有報道［14-15］。但由于本研究所納入的研究樣本數(shù)量還相對較少，此結(jié)論有待于在中國人群中進行大樣本的研究來證實。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Hp的感染與患者外周血的IL-10水平相關(guān)，且二者均與中醫(yī)CAG的證型相關(guān)，提示中醫(yī)治療CAG時應(yīng)關(guān)注患者的Hp感染及患者的IL-10水平。

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［2］ 中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化系統(tǒng)疾病專業(yè)委員會．慢性胃炎的中西醫(yī)結(jié)合診治方案(草案)［C］．重慶:中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(2):172-175．

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Study on the Association between the Distribution of Syndrome Type of Patients with Chronic Atrophic Gastritis(CAG)and Helicobacter pylori and IL-10

LIU Chang-ming，F(xiàn)ENG Quan-lin，ZHANG Jian-zhi，HU Yi-lu，YANG Di，ZHANG Ying△
(Department of Laboratory Medicine，Kunshan Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Kunshan，Jiangsu 215300，China)

Objective:To explore the association between the distribution of syndrome type of patients with chronic atrophic gastritis(CAG)and Helicobacter pylori(Hp)infection and the level and polymorphisms of IL-10．Methods:156 CAG patients and 150 health people without Hp infection were enrolled;The Hp infection was tested by13C-Urea Breath Test and colloidal gold-labeled assay(GICA);The level of IL-10 was measured by Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA);Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism(PCR-RFLP)was applied to genotype the polymorphisms of IL-10．Results:In the CAG patient，the number of the syndrome type of weakness of spleen and stomach，deficiency of stomach-yin were majority．The Hp infection ratio of CAG was 49.37%，and it was higher in the patients with syndrome type of damp-heat in spleen and stomach(69.23%)，disharmony between liver and stomach (68.42%)and blood stasis of the collaterals(57.14%)，and there was significant difference between them．The IL-10 level in the patients with type of syndrome of damp-heat in spleen and stomach(55.57±12.31pg/ml)and disharmony between liver and stomach(48.38±13.91pg/ml)was significant higher than that in health controls(38.21±5.35pg/ ml)．There was no difference of the distribution of IL-10 genotypes between patients and health controls．Conclusion:The Hp infection was related with IL-10 level in the CAG patents．the Hp infection and IL-10 level were associated with the syndrome type of CAG patients．It is indicated that Hp infection and level IL-10 should be considered in the treatment for the CAG patients according to the syndrome type．

Chronic Atrophic Gastritis(CAG);Syndrome types;Helicobacter pylori infection;IL-10; polymorphism

R573．3+2

B

1006-3250(2015)10-1271-04

2015-02-18

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(LZ13157，YB2015105);昆山市科技發(fā)展項目(ks1361，ks1259)，(LZ13157，ks1361):胃炎I號方辨證治療CAG的機制探討與療效觀察(ks1259):幽門螺旋桿菌致病島的基因變異與Th1型細胞因子的遺傳多樣性的交互作用致胃癌發(fā)生風(fēng)險研究;幽門螺旋桿菌基因分型與胃部疾病證型及藥物敏感性的相關(guān)性研究(YB2015105)

劉長明，男，江蘇金湖人，副主任技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事醫(yī)學(xué)檢驗的臨床與研究。

張 穎，女，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:kszyy_zy@126．com。