2型糖尿病腎病氣陰兩虛型動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)*

胡愛民，晏 玲，張利芳，趙 靜，張顯林，萬(wàn)巧巧

(1．武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014;2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)研究生，武漢 430014)

2型糖尿病腎病氣陰兩虛型動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)*

胡愛民1，晏 玲1，張利芳1，趙 靜1，張顯林1，萬(wàn)巧巧2

(1．武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014;2．湖北中醫(yī)藥大學(xué)研究生，武漢 430014)

目的:建立2型糖尿病腎病氣陰兩虛型病證結(jié)合動(dòng)物模型。方法:雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(C 組)和模型組(M組)，空白對(duì)照組(C組)通過單腎切除、高脂飼料、小劑量STZ腹腔注射、行為干預(yù)(饑飽失常、過度疲勞、驚嚇)建立模型組(M組)，模型動(dòng)物給予益氣養(yǎng)陰中藥干預(yù)(Z組)。16周后檢測(cè)各組大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白定量、尿β2微球蛋白、腎功能、右腎重/體質(zhì)量等指標(biāo);光鏡下觀測(cè)腎組織病理。結(jié)果:與C組比較，M組大鼠腎功能無(wú)明顯變化，余指標(biāo)均有顯著變化。與M組比較，Z組大鼠腎功能無(wú)變化，其余指標(biāo)均有顯著改善。光鏡結(jié)果顯示，M組腎組織出現(xiàn)了較明顯的病理改變，而Z組病變程度有所減輕。M組大鼠出現(xiàn)氣陰兩虛證型表現(xiàn)，Z組大鼠上述表現(xiàn)有明顯改善。結(jié)論:通過單腎切除、高脂飼料、小劑量STZ腹腔注射、一定的行為干預(yù)方式，可制備2型糖尿病腎病氣陰兩虛型病證結(jié)合動(dòng)物模型。

2型糖尿病腎病;氣陰兩虛型;動(dòng)物模型

為研究方便，筆者采用單腎切除、高脂飼料、小劑量STZ腹腔注射、行為干預(yù)方法，試圖建立與臨床相吻合的2型糖尿病腎病氣陰兩虛型病證結(jié)合大鼠模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。高脂飼料由基礎(chǔ)飼料、豬油、膽固醇粉、膽酸鈉粉按87．5%、10%、2%、0．5%比例混合而成。

1．2 藥物及試劑、儀器

益氣養(yǎng)陰中藥復(fù)方由生黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七等中藥組成，用“水煮醇提法”制備成浸膏，用生理鹽水稀釋成每毫升含生藥2．5 g的溶液。鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)，以0．1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH=4．4)配成2．0%STZ溶液。強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)血糖儀由強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司提供;血糖試劑盒購(gòu)自購(gòu)自南京建成生物工程研究所;血清胰島素、尿β2微球蛋白試劑盒購(gòu)自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司;血脂、腎功能試劑盒購(gòu)自北京恩濟(jì)和生物有限公司;尿微量白蛋白試劑盒購(gòu)自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1．3 動(dòng)物分組及處理

Wistar大鼠36只適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型制備組26只和空白對(duì)照組(C組)10只，模型制備組以1% 戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，背部切口1～1．5 cm暴露左腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結(jié)扎左腎門血管，切除左腎并縫合切口，5萬(wàn)U青霉素腹腔注射。術(shù)后肌注2 萬(wàn)U青霉素共1周。C組大鼠僅完全暴露左腎并不作任何處理。1周后模型制備組給予高脂飼料，C組給予基礎(chǔ)飼料，自由飲水，喂養(yǎng)2周。模型制備組腹腔注射STZ 30 mg/kg，C組注射等量0．1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。72 h后行糖耐量試驗(yàn)(OGTT，按2．2 g/kg喂以葡萄糖水、剪尾取血，葡萄糖氧化酶電化學(xué)法測(cè)血糖)，空腹血糖≥5．6 mmol/ L，負(fù)荷后2 h血糖≥7．8 mmol/L為造模初步成功，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(M組)和中藥組(Z 組)。Z組以10 g/kg·d灌胃，M組和C組灌予等體積的飲用水，頭4周M組和Z組給予饑飽失常(單日禁食，自由飲水;雙日不限量給予高糖高脂飼料，自由飲水)、過度疲勞(反復(fù)于(43±0．5)℃、水深35 cm的恒溫水槽中游泳，自然下沉?xí)r從水槽取出，每日1次)、驚嚇(貓叫聲嚇鼠、棍棒敲鼠籠，每日1次)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1周采用金屬代謝籠收集24 h尿標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d行OGTT實(shí)驗(yàn)(葡萄糖氧化酶法)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12～14 h稱重，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血分離血清，剝離右側(cè)腎臟，生理鹽水清洗并吸干水分稱重，留取部分腎組織固定備用。

1．4 檢測(cè)方法

所有指標(biāo)均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊采用t’檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

單腎切除后所有大鼠均存活，STZ腹腔注射3 d后，共有3只大鼠死亡，第2、6、7周Z組分別死亡1只，第9、12周M組分別死亡1只，造模成功率69．23%。

2．1 各組大鼠 FBG、P2hBG、FINS、P2hINS、HOMA-IR、體質(zhì)量結(jié)果比較(表1)

2．2 各組大鼠TC、TG、HDL-c、LDL-c結(jié)果比較(表2)

2．3 各組大鼠BUN、Creat、24 h尿白蛋白定量、右腎重/體質(zhì)量結(jié)果比較(表3)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、FBG、P2hBG、FINS、P2hINS、HOMA-IR結(jié)果比較

表2 各組大鼠TC、TG、HDL-c、LDL-c結(jié)果比較

表3 各組大鼠血BUN、Creat、24 h尿白蛋白定量、右腎重/體質(zhì)量結(jié)果比較

2．4 腎組織病理結(jié)果

C組大鼠腎小管、小管間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)清楚，腎小管上皮細(xì)胞呈方形、大小一致、排列整齊;基底膜完整，間質(zhì)中未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生及腎小球硬化。M組局部腎小管間質(zhì)纖維化伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，如黑色箭頭所示;部分腎小球系膜細(xì)胞增生，如紅色箭頭所示;中等數(shù)量的腎小球壁層上皮細(xì)胞增生，如黃色箭頭所示;部分腎小管上皮細(xì)胞脫落，顆粒變性，如藍(lán)色箭頭所示。Z組腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，如黑色箭頭所示;部分腎小管顆粒變性，如紅色箭頭所示。3個(gè)組的病變程度由輕到重依次為C組、Z組、M組(圖1)。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化(HE染色 ×400)

2．5 各組大鼠一般情況

C組大鼠飲食、飲水正常，尿量正常，大便黑褐色顆粒狀，肌肉豐滿，毛發(fā)潔白順滑，精神飽滿，雙目有神，反應(yīng)靈敏，舌淡紅潤(rùn)澤;M組大鼠出現(xiàn)飲食、飲水、尿量增多、身體消瘦、拉尾排便、排尿等糖尿病大鼠的共同特征，同時(shí)還伴有倦怠懶動(dòng)、喜蜷臥或成堆趴臥，少數(shù)急躁易怒、易驚恐斗毆、毛色暗黃無(wú)光澤、舌胖大少津等氣陰兩虛表現(xiàn)，而Z組大鼠上述癥狀和體征均有一定程度的改善。

3 討論

糖尿病腎病(DN)是終末期腎病(ESRD)最主要的原因之一［1-2］，約占全部ESRD病例的44%［3］，研究糖尿病腎病中醫(yī)現(xiàn)代機(jī)制受到人們的重視，故建立一個(gè)與臨床表現(xiàn)相吻合的病證結(jié)合動(dòng)物模型尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)外主要采用誘導(dǎo)形成、自發(fā)形成和基因工程制備DN模型［4］。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［5-8］，一方面，用單側(cè)腎切除、高脂飼料喂養(yǎng)、小劑量STZ腹腔注射，建立2型糖尿病腎病動(dòng)物模型。研究表明［9］，高脂飼料喂養(yǎng)、小劑量STZ腹腔注射符合2型糖尿病病理生理特征，單側(cè)腎摘除加速DN的形成。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠出現(xiàn)體胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、白蛋白尿及尿β2-微球蛋白和腎組織病理變化，而腎功能指標(biāo)尚未明顯升高，其發(fā)病過程及特征與糖腎患者的臨床表現(xiàn)基本類似，具備早中期2型糖尿病腎病的典型特點(diǎn)。另一方面，DN屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”、“水腫”、“尿濁”、“消腎”、“虛勞”、“關(guān)格”等范疇。氣陰兩虛是本病基本病機(jī)，病位主要在脾腎。本研究根據(jù)中醫(yī)學(xué)“飲食自倍，腸胃乃傷”(《素問·痹論論》)、“勞則氣耗”(《素問·舉痛論》)、“恐傷腎”(《素問·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》)、“恐則氣下”(《素問·舉痛論》)的理論指導(dǎo)，采用饑飽失常、過度疲勞、驚嚇的“行為干預(yù)”方式喂養(yǎng)模型動(dòng)物。與對(duì)照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯氣陰兩虛癥狀，而益氣養(yǎng)陰中藥組大鼠癥狀改善，無(wú)論是從臨床表現(xiàn)還是以方藥反證，2型糖尿病腎病大鼠氣陰兩虛證型成立?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，大鼠因驚嚇致應(yīng)激而產(chǎn)生IL-6、TNF-α等升高，IL-10減少［10］，從而促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展［11］。同時(shí)激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，導(dǎo)致腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變和腎臟損害［12］;過度運(yùn)動(dòng)時(shí)血液的重新分配、缺血再灌注損傷是蛋白尿形成的基礎(chǔ)［13］。陳璐璐等采用半量普通飲食喂養(yǎng)4周后，自由開放飲食喂養(yǎng)8周，82.25%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在限食后開放飲食過程中出現(xiàn)“追趕生長(zhǎng)”，導(dǎo)致動(dòng)物胰島素抵抗［14］，“饑飽失?！毙袨榕c其相似。

目前有報(bào)道在小劑量STZ注射加高脂高糖喂養(yǎng)建立糖尿病基礎(chǔ)上，有人給予苦寒中藥等建立陽(yáng)虛糖腎模型和氣陰兩虛糖尿病模型［15］。我們認(rèn)為，藥物干預(yù)建立病證結(jié)合模型不利于下一步開展的中藥研究，故我們?cè)?型糖尿病腎病模型基礎(chǔ)上采用“行為干預(yù)”方法建立氣陰兩虛病證結(jié)合模型，為下一步的工作打下基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究首次在傳統(tǒng)方法單腎切除、高脂飲食、小劑量STZ腹腔注射制作糖尿病腎病模型基礎(chǔ)上，在中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，首次運(yùn)用“行為干預(yù)”方式，初步建立了既有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)2型糖尿病腎病特征、又符合中醫(yī)學(xué)氣陰兩虛證型特點(diǎn)的病證結(jié)合大鼠模型。我們認(rèn)為，此模型與人類2型糖尿病腎病氣陰兩虛型的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果相似，且耗時(shí)較短、成本低、成功率高、易推廣;特別是改變了現(xiàn)有報(bào)道中用苦寒、溫陽(yáng)、破氣等中藥制作相應(yīng)中醫(yī)證候模型的現(xiàn)狀，為方便后續(xù)中醫(yī)藥干預(yù)研究打下基礎(chǔ)，是一種研究2型糖尿病腎病氣陰兩虛型病證結(jié)合良好的動(dòng)物模型。

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Establishment and Evaluation about Rat Models of Qi and Yin Deficiency in Type 2 Diabetic Nephropathy

HU Ai-min1，YAN Ling1，ZHANG Li-fang1，ZHAO Jing1，ZHANG Xian-lin1，WAN Qiao-qiao2
(1．Wuhan hospital of Traditional Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430014，China; 2．Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430014，China)

Objective:To establish models of Qi and Yin deficiency disease andsyndrome in type 2 Diabetic Nephropathy．Methods:Male Wistar rats were ran-domly divided into model preparation group and control group (group C)，prepared using unilateral nephrectomy+high-fat diet+ low dose of streptozotocin by intraperitoneal injection，combined behavioral manner intervention，animalmodel group(M group)and Yiqiyangyin medicine group (Z group)．Z rats orally administered Yiqiyangyin medicine 16weeks，the rest of the groupto an equal volume of water．After16 weeks，detecte body weight，fasting bloodglucose、fasting serum insulin(FINS)，insulin(P2hINS) afterload，insulin resistance index(HOMA-IR)，24-hour urinary albumin quantification，urineβ2 microglo-bulin、blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，kidney weight/body weight and other indicators of the rats;Light microscope observe pathology of the renal;Results:Compared with group C，M group weight，Creatno significant change，the other indexes were significantly improve．Compared with M group，Z rats BUN，Creatno significant change，the other indexes were significantly improve．Lightmicroscopy:M renal tissue appeared obvious pathological changes，and Z group lesions abated．M rats appear Qi andYin Deficiency performances，and Z rats had significant improvement to the performance．Conclusion:by unilateral nephrectomy + high-fat diet+ alow doseof STZ，combined with irregular diet，fatigue，behavioral manner intervention，models of Qi and Yin deficiency disease and syndrome in type 2 Diabetic Nephropathy ratswere successfully established．

Type 2 diabetic nephropathy;Qi and Yin deficiency;Animal model

R587．1

B

1006-3250(2015)10-1251-03

2015-04-06

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委(2013Z-Y36);武漢市2014年“黃鶴英才(醫(yī)療衛(wèi)生)”計(jì)劃;武漢市衛(wèi)生局(武衛(wèi)(2009)76號(hào))

胡愛民(1963-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)內(nèi)分泌代謝病的臨床與研究。