槲皮素對2型糖尿病大鼠腎臟肥大的影響機(jī)制*

王興紅，常陸林，王桂葉，劉會君

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河 462000)

槲皮素對2型糖尿病大鼠腎臟肥大的影響機(jī)制*

王興紅，常陸林，王桂葉，劉會君

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河 462000)

目的:觀察槲皮素對2型糖尿病大鼠腎臟肥大的影響并探討其作用機(jī)制。方法:建立2型糖尿病大鼠模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、糖尿病模型組以及槲皮素組，測定各組大鼠血糖、血脂、總膽固醇、血清胰島素、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、腎臟肥大指數(shù)和單根近端小管(PT)鈉鉀ATP酶(Na+，K+-ATPase)活性，免疫組化法測定腎臟Toll樣受體4(TLR4)蛋白表達(dá)。結(jié)果:與模型組比較，槲皮素組大鼠血糖、血脂、總膽固醇、血清胰島素水平、腎臟肥大指數(shù)、Na+，K+-ATPase活性和腎內(nèi)TLR4蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:槲皮素能抑制2型糖尿病大鼠腎臟肥大，其機(jī)制可能與降低血糖、血脂、總膽固醇和腎臟TLR4蛋白表達(dá)，升高ISI及穩(wěn)定Na+，K+-ATPase活性有關(guān)。

2型糖尿病;槲皮素;腎臟肥大;Toll樣受體4;鈉鉀ATP酶

目前我國2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，故遴選有效、毒副作用小的中藥用于T2DM防治具有重要的臨床價值。槲皮素(Quercetin，Que)是一種天然的黃酮類化合物，因其具有廣泛的藥理作用，愈來愈受到人們的重視，它是具有多靶點作用和綜合治療優(yōu)勢的中藥單體。研究表明［1］，Que對大鼠慢性腎功能衰竭具有防治作用，但機(jī)制尚未明確。課題組前期研究顯示［2］，Que可以抑制糖尿病大鼠腎臟肥大并保護(hù)腎功能。為進(jìn)一步揭示其機(jī)制，本研究腹腔注射Que，觀察腎臟Toll樣受體4(TLR4)的蛋白表達(dá)、近端小管(PT)的鈉鉀ATP酶(Na+，K+-ATPase)活性、胰島素敏感指標(biāo)數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)等變化，為臨床應(yīng)用Que提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與飼料 30只成年健康雄性SD清潔級大鼠，體質(zhì)量300～350 g，由河南省實驗動物中心提供(合格證號410117)，飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施要求?；A(chǔ)飼料:57%碳水化合物，22%蛋白質(zhì)，6%脂肪，8%纖維素，7%其他成分。高能飼料:60%基礎(chǔ)飼料，20%蔗糖，20%豬油，由河南省實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物和試劑 槲皮素(批號100123，Sigma公司)，鏈脲佐菌素(批號090412，Sigma公司)，TLR4小鼠抗大鼠單克隆抗體(批號110812，美國Santa Cruz公司)，總膽固醇、甘油三酯檢測試劑盒(批號090311、090406，南京建成生物公司)，胰島素放射免疫檢測試劑盒(批號090621，北京北方生物技術(shù)研究所)，Na2ATP、哇巴因(ouabain，Sigma公司)，膠原酶II、EGTA(Gibco公司)，［γ-32P］ATP(北京福瑞特公司)。

1.1.3 主要儀器 三諾SXT-1型快速血糖測定儀(長沙)，SN-6930A型液閃儀與SN-6100型γ計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電公司)，CM1900-1-1恒冷箱冰凍切片機(jī)(德國 Leica)，倒置光顯微鏡(德國Leica)，UV7501紫外分光光度計(無錫科達(dá)儀器廠)，MiVnt顯微生物圖像分析系統(tǒng)(北京瑞宏誠科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分組與給藥 成年健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照王保偉［3］等方法建立T2DM大鼠模型，隨機(jī)血糖≥16.65 mmol/L為糖尿病大鼠。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、糖尿病模型組和槲皮素組(50 mg/kg·d，臨用前用生理鹽水配成含槲皮素10 g/L的溶液)灌胃治療8周。正常組和糖尿病模型組按體質(zhì)量換算等體積生理鹽水灌胃8周。在實驗過程中模型組2只大鼠因高血糖死亡，最終28只完成實驗，其中正常對照組10只，模型組8只，槲皮素組10只。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理 實驗動物于槲皮素治療8周末空腹12 h，心臟采血離心后－70℃保存?zhèn)溆?處死大鼠剖腹取雙腎，去包膜、稱重、計算腎臟肥大指數(shù)(腎臟肥大指數(shù) =雙側(cè)腎質(zhì)量/體質(zhì)量×%)。右腎用于PT的鈉鉀ATP酶活性測定，左腎固定、石蠟包埋做4μm厚度非連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.3 生化和放免檢測 空腹血糖(FBG)快速血糖儀測定;甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)均采用紫外分光光度計測定;胰島素水平(FINS)采用放射免疫分析法測定并計算胰島素敏感指數(shù)(IsI)［4］。以上項目均由漯河市中心醫(yī)院檢驗科測定。

1.2.4 Na+，K+-ATPase活性測定 顯微鏡下挑取各組PT，參照沈東波等改良的方法［5］測定PT管周膜Na+，K+-ATPase活性。Na+，K+-ATPase活性(μmol/g/h)=(X-B)/蛋白濃度×樣本體積×孵育時間(h)×SRA。X為待測樣本的液體閃爍計數(shù)值，B為空白對照管的液體閃爍計數(shù)值，SRA為［γ-32P］ATP的比活性。

1.2.5 免疫組化SP法檢測腎臟TLR4蛋白表達(dá) 取腎組織切片烤片，常規(guī)脫蠟至水、抗原微波熱修復(fù)、山羊血清液封閉;滴加TLR4一抗(1∶100稀釋)，4。C孵育1 h，滴加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，滴加HRP標(biāo)記鏈親和素孵育10 min，滴加DAB顯色，蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡觀察。TLR4蛋白表達(dá)以細(xì)胞或結(jié)構(gòu)周圍不同程度的棕黃色為陽性。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，觀察各組大鼠腎TLR4的定位和表達(dá)。每只大鼠觀察4張切片，每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)的5個陽性視野，觀察陽性染色部位并采集圖像后結(jié)合IMAGE J軟件，分析求得平均光密度值(IOD)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與正常對照組比較，糖尿病模型大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食等癥狀，毛發(fā)色澤黯淡，精神萎靡，活動減少，隨著病程延長，除大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢外，其他癥狀更加明顯;與糖尿病模型組比較，槲皮素治療8周后上述癥狀體征得到改善。

2.2 血清生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)

表1顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型大鼠TC、TG、FBG、腎臟肥大指數(shù)顯著升高(P＜0.05或P ＜0.01);與模型組比較，槲皮素組大鼠 TC、TG、FBG、腎臟肥大指數(shù)顯著降低(P＜0.05或 P＜0.01)。

表1 藥物干預(yù)8周不同組別TC、TG、FBG、腎臟肥大指數(shù)比較

2.3 血清 FINS、IsI和 PT管周膜 Na+，K+-ATPase活性

與正常對照組比較，糖尿病模型大鼠FINS水平、Na+，K+-ATPase活性顯著升高，IsI顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);與糖尿病模型組比較，槲皮素組大鼠FINS水平、Na+，K+-ATPase活性顯著降低，ISI顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 藥物干預(yù)8周不同組別血清FINS、IsI和Na+，K+-ATPase活性

2.4 免疫組化SP法檢測腎臟TLR4蛋白表達(dá)圖1、表2顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型大鼠腎臟TLR4蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，槲皮素組大鼠腎臟TLR4蛋白表達(dá)顯著顯著降低(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠腎臟TLR4蛋白表達(dá)的變化(免疫組化SP法 ×400)

3 討論

2型糖尿病(T2DM)是一種慢性、全身代謝性疾病，表現(xiàn)為胰島素分泌相對不足或胰島素抵抗、高血糖及血脂紊亂等。根據(jù)T2DM發(fā)病機(jī)制，本實驗選用雄性SD大鼠高脂喂養(yǎng)4周，腹腔一次性注射STZ 45 mg/kg誘導(dǎo)胰島素抵抗，大鼠出現(xiàn)高血糖、高TC、高TG和胰島素敏感性(ISI)下降，同時伴有多飲、多尿、多食等癥狀，類似臨床T2DM病人“三多一少”癥狀，提示糖尿病模型制備成功。而經(jīng)Que治療8周后，大鼠血清FBG、TC、TG得到明顯改善，ISI顯著升高，“三多一少”癥狀也得到一定程度改善，提示Que對T2DM具有一定的治療作用。

Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)是細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白［6］。TLR4是TLRs家族中最重要的成員，可以介導(dǎo)多種炎癥及急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子形成，其在糖尿病腎病(DN)發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。王建平等［7］的研究證實，糖尿病大鼠腎臟TLR4表達(dá)明顯上調(diào)，并參與DN的進(jìn)展。本研究也顯示，模型大鼠腎臟TLR4表達(dá)明顯增加，而經(jīng)過Que治療后明顯降低且腎臟肥大指數(shù)顯著減小。Que是一種天然的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗黏附、抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低血壓以及免疫調(diào)節(jié)作用［8］。Que可以降低腎組織丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活力并減少尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24 h蛋白尿，抑制腎內(nèi)一氧化氮合酶活性和一氧化氮(NO)水平，抑制糖尿病腎臟早期的高灌注、高濾過［2］。Que作為一種有效的抗氧化和抗炎劑，對DN的發(fā)展起到一定的抑制作用，其機(jī)制可能是通過改善氧化應(yīng)激、抑制腎內(nèi)TLR4的表達(dá)，進(jìn)而切斷TLR4介導(dǎo)的多種介導(dǎo)炎癥及急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子形成，從而減輕腎臟炎癥的損害。

腎小管上皮細(xì)胞生長異常導(dǎo)致糖尿病早期腎臟增大、腎小管過度重吸收和腎小球高濾過，影響腎臟病變的進(jìn)程，這與多個分子及信號通路、炎性反應(yīng)和纖維化密切相關(guān)［9］。Na+，K+-ATPase是近端小管上皮細(xì)胞管周膜上的重要離子泵，參與多種物質(zhì)的重吸收。其活性反映了腎小管的功能狀態(tài)，活性顯著升高，與DN的發(fā)生發(fā)展有顯著的相關(guān)性［10］。本研究提示，Que抑制腎臟肥大的機(jī)制可能與降低血糖、血脂等物質(zhì)在近端小管上皮細(xì)胞的重吸收和轉(zhuǎn)運過程，穩(wěn)定Na+，K+-ATPase的活性有關(guān)，具體的途徑有待進(jìn)一步的深入研究。

［1］ 李列平，李雄，彭自全，等．槲皮素對大鼠慢性腎功能衰竭及促紅細(xì)胞生成素水平的影響［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)，2004，24 (7):412-413．

［2］ 王興紅，鄭亞萍，魏芳．槲皮素對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠氧自由基和一氧化氮的影響［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(5):244-247．

［3］ 王保偉，李穎，劉曉紅，等．高脂飼料喂養(yǎng)時間及鏈脲佐菌素劑量對實驗型2型糖尿病大鼠造模的影響［J］．衛(wèi)生研究，2011，40(1):99-102．

［4］ 李光偉，潘孝仁，Lillioja，等．檢測人群胰島素敏感性的一項新指數(shù)［J］．中華內(nèi)科雜志，1993，32(10):656．

［5］ 沈東波，高原，杜飛．燈盞花素在大鼠糖尿病早期對近球小管鈉鉀ATP酶活性的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2007，23(7): 917-920．

［6］ The role of toll-like receptors in diabetes-induced inflammation: implications for vascular complications［J］．Current diabetes reports，2012，12:172-179．

［7］ 王建平，臧麗，張世靜，等．辛伐他汀對糖尿病大鼠腎組織Toll樣受體4表達(dá)的影響［J］．中華內(nèi)分泌代謝雜志，2011，27(11):945-946．

［8］ CM Liu，YZ Sun，JM Sun，et al．Protective role of quercetin against lead-induced inflammatory response in rat kidney through the ROS-mediated MAPKs and NF-κB pathway［J］．Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects，2012，1820(10): 1693-1703．

［9］ Kanwar YS，Sun L，Xie P，et al．A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy［J］．Annu RevPathol，2011，6:395-423．

［10］ Nakhoul N，Batuman V．Role of Proximal Tubules in the Pathogenesis of Kidney Disease［J］．Contrib Nephrol，2011，169: 37-50．

Influencing Mechanism of Quercetin on Kidney Hypertrophy in Type 2 Diabetic Rats

WANG Xing-hong，CHANG Lu-lin，WANG Gui-ye，LIU Hui-jun
(Luohe Medical College，Luohe，Henan，462000，China)

Objective:To observe the effect of quercetin on diabetic rats’kidney hypertrophy and explore its mechanism．Methods:The model of type 2 diabetic rates was made．The rats were randomly divided into three groups: normal group，diabetic model group，and quercetin group．The blood sugar，blood fat，total cholesterol，serum insulin level，insulin sensitivity index(ISI)，KW/BW，Na+，K+-ATPase activity of PT were measured．The toll-like receptor 4(TLR4) protein expression was measured by immunohistochemical method．Results:Compared with the model group，The blood sugar，blood fat，total cholesterol，serum insulin level，KW/BW，Na+，K+-ATPase activity of PT，TLR4 protein expression were significantly reduced，so the differences were statistically significant．Conclusion:Quercetin can inhibit kidney hypertrophy，it may be caused by the decrease of blood sugar，blood fat，cholesterol，TLR4 protein expression and increase of ISI and stabilization of Na+，K+-ATPase activity of PT in T2DM rats．

Type 2 diabetes mellitus;Quercetin;Kidney hypertrophy;TLR4;Na+，K+-ATPase

R285．5

B

1006-3250(2015)10-1248-03

2015-03-11

河南省教育廳高等學(xué)校重點科研項目(15B180011);漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校級自然科學(xué)研究資助項目(2013-S-LMC24)

王興紅(1981-)，女，山東臨沂人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與防治研究。