左、右歸丸對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成脂誘導(dǎo)的研究*

徐 巖，宋 囡，任艷玲△

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600;2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110847)

左、右歸丸對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成脂誘導(dǎo)的研究
*

徐 巖1，宋 囡2，任艷玲2△

(1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600;2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110847)

目的:研究體外左、右歸丸誘導(dǎo)大鼠骨髓充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)成骨及成脂的影響。方法:以左、右歸丸水煎液和陽(yáng)性對(duì)照藥補(bǔ)佳樂、蒸餾水分別給予SD大鼠灌胃取血制備含藥血清，分別加成骨和成脂誘導(dǎo)劑干預(yù)BMSCs，成骨誘導(dǎo)后采用改良鈣鈷法檢測(cè)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)表達(dá)，成脂誘導(dǎo)第10天油紅O染色。結(jié)果:左、右歸丸組與空白組比較，可顯著提高細(xì)胞中ALP活性，促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)形成;左、右歸丸可減少脂滴形成，降低細(xì)胞中甘油三酯含量。結(jié)論:左、右歸丸對(duì)BMSCs分化的調(diào)節(jié)具有雙向性，既促進(jìn)BMSCs成骨分化同時(shí)又抑制BMSCs成脂分化。

左歸丸;右歸丸;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成脂;成骨

骨髓充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstromalstem cells，BMSCs)是一種成體多能干細(xì)胞，可在不同生物環(huán)境和細(xì)胞因子作用下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等［1］。作為具有多向分化潛能及自我更新能力的干細(xì)胞，它能夠通過分化成為成骨細(xì)胞促進(jìn)骨生成［2］。隨著年齡增長(zhǎng)及骨髓內(nèi)微環(huán)境變化，BMSCs更趨向成脂分化形成脂肪細(xì)胞，同時(shí)使成骨能力減弱，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。目前對(duì)髓腔中最豐富的脂肪細(xì)胞研究較少，尤其是對(duì)中醫(yī)補(bǔ)腎益精的經(jīng)典代表方左、右歸丸在成脂誘導(dǎo)方面的研究較為罕見。根據(jù)“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”理論，我們側(cè)重同時(shí)研究左、右歸丸對(duì)成骨和成脂誘導(dǎo)這兩方面的作用，實(shí)驗(yàn)中對(duì)體外細(xì)胞分別加成骨及成脂誘導(dǎo)劑觀察二者的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠20只，體質(zhì)量(210±10)g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各5只，以制備含藥血清，采用同種2月齡雄性大鼠1只提取和培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，大鼠均由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào)SCXK(遼) 2010-0001)。

1.1.2 藥物及試劑 本實(shí)驗(yàn)中藥飲片均在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院購(gòu)買。左歸丸組成:熟地黃24g，炒山藥12g，枸杞子12g，山茱萸12g，鹿角膠12g，菟絲子12g，牛膝9g，龜板膠12g，右歸丸:熟地黃24g，炒山藥12g，枸杞子12g，山茱萸12g，鹿角膠12g，菟絲子12g，當(dāng)歸9g，肉桂6g，杜仲9g，附子6g。將2種藥制備為水煎劑，生藥量為1 g·mL－1;補(bǔ)佳樂戊酸雌二醇片(法國(guó) DELPHARM LilleS．A．S．批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字J20080036);改良型α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清FBS(Hyclone);胰酶、油紅O、地塞米松、3-異丁基-1甲基黃嘌呤IBMX、吲哚美辛(Sigma);胰島素(Biotopped)。

1.1.3 儀器 3111二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó));DFC320型倒置顯微鏡(Leica，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備與實(shí)驗(yàn)分組 表1顯示，20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為左歸丸組(ZGW)、右歸丸組(YGW)、補(bǔ)佳樂組(BJL)、空白對(duì)照組(Control)4組各5只。以每kg體質(zhì)量大鼠的給藥量為正常人給藥量6.3倍，每次大鼠給藥量以正常人給藥量的2倍計(jì)算，計(jì)算后為左歸丸組18.9g· kg－1體質(zhì)量，右歸丸組20.52g·kg－1體質(zhì)量，西藥組0.18mg·kg－1體質(zhì)量，空白對(duì)照組1.0g·kg－1體質(zhì)量，每日灌服2次，相當(dāng)于藥物生藥量的1g·mL－1，空白對(duì)照組灌服蒸餾水。第4天早晨給藥2h后麻醉，腹主動(dòng)脈取血后靜置2h，離心(2500rpm，4℃，20min)后收集血清，56℃水浴滅活30min后分裝，－86℃保存。實(shí)驗(yàn)分為成骨和成脂誘導(dǎo)兩部分，分別為4組。其中成骨誘導(dǎo)劑含10－7mol·L－1地塞米松、10mmol·L－1β-甘油磷酸鈉和50μmol·L－1維生素C的α-MEM培養(yǎng)液，成脂誘導(dǎo)劑含1μmol·L－1地塞米松、10μg·ml－1胰島素、100μmol·L－1吲哚美辛和500μmol·L－13-異丁基-1甲基黃嘌呤(IBMX)的α-MEM培養(yǎng)液。

表1 各實(shí)驗(yàn)分組

1.2.2 BMSCs的分離培養(yǎng) 頸椎脫臼法將2月齡左右SD大鼠處死，浸泡在75%乙醇中15min后移入超凈臺(tái)，迅速取出雙側(cè)股骨及脛骨并剪去骨兩端，用含青、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液5mL反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨顏色變白，培養(yǎng)液移入離心管中，離心(1000rpm/3min)并棄去上清液，用含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)吹打，使細(xì)胞重懸放入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)至P4代時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 改良鈣鈷法檢測(cè)ALP表達(dá) 3%β-甘油磷酸鈉、2%巴比妥鈉、2%無水氯化鈣、2%硫酸鎂和蒸餾水5ml配制ALP染色孵育液(pH9.4)。細(xì)胞以每孔500μL接種于24孔培養(yǎng)板中，藥物干預(yù)14d后棄原培養(yǎng)液，95%乙醇固定15min后干燥，加新配孵育液，培養(yǎng)箱中孵育4h后流水洗10min，在2%硝酸鈷中作用5min后去離子水洗片刻，用現(xiàn)配1%硫化銨溶液處理1min，再用水沖洗、晾干，倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 油紅O染色及定量 將BMSCs接種于24孔板(每孔200μL)，于1d后加含10%各組含藥血清的成脂誘導(dǎo)液，第4天換含10%各組含藥血清的成脂維持液，繼續(xù)培養(yǎng)7d后去孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS清洗3次，多聚甲醛固定20min后PBS潤(rùn)洗3次、吸干，0.5%油紅O染色1h，蒸餾水洗3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 LSD或Tamhane's方法，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶24h后可見少量透亮細(xì)胞貼壁，以圓形居多。4d后可見大部分細(xì)胞形成突觸，在細(xì)胞呈多角形或菱形時(shí)第1次換液，約10d后細(xì)胞融合率達(dá)80%左右時(shí)首次傳代，細(xì)胞傳到P4代多呈紡錘形生長(zhǎng)，排列多成旋渦狀(圖1)。

圖1 BMSCs細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2 改良鈣鈷法染色及結(jié)果

采用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)大鼠BMSCs細(xì)胞后，細(xì)胞合成的ALP經(jīng)過改良鈣鈷法染色，陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)含有棕黑色細(xì)微顆粒。實(shí)驗(yàn)各組染色均有差異。與Control+GYDJ組比較，ZGW+GYDJ組、YGW+ GYDJ組、BJL+GYDJ組棕黑色顆粒明顯較多，細(xì)胞突觸多而長(zhǎng)且密度增大，均能顯著增強(qiáng)BMSCsALP活性(P＜0.05)。與ZGW+GYDJ組比較，BJL+ GYDJ組、YGW+GYDJ組的BMSCsALP活性誘導(dǎo)明顯減弱(P＜0.05)，且YGW+GYDJ組優(yōu)于BJL+ GYDJ組(P＜0.05)。

2.3 油紅O染色結(jié)果

采用成脂誘導(dǎo)后，部分細(xì)胞體積增大，梭形變圓形，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)并含大小不等高亮度串珠狀脂肪滴，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，含脂滴細(xì)胞數(shù)增多，脂滴體積增大，占細(xì)胞體的50%左右。油紅O染色陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)脂滴被染成亮紅色，誘導(dǎo)第10天各組油紅染色均有差異，與Control+ZYDJ組比較，ZGW+ZYDJ組、YGW+ZYDJ組、BJL+ZYDJ組亮紅色含脂滴細(xì)胞均減少，脂滴體積變小，均顯著抑制BMSCs脂肪滴的形成(P＜0.05)。與BJL+ZYDJ組比較，ZGW+ZYDJ組、YGW+ZYDJ組亮紅色脂滴細(xì)胞數(shù)量減少更明顯，脂滴體積較小，均顯著抑制BMSCs脂肪滴的形成(P＜0.05)。而ZGW+ZYDJ組與YGW+ZYDJ組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 左、右歸丸含藥血清對(duì)BMSCs成骨的影響(×200) A．Control+GYDJ組;B．BJL+GYDJ; C．YGW+GYDJ組;D．ZGW+GYDJ組

圖3 左、右歸丸含藥血清對(duì)BMSCsALP活性的影響(×200) A．Control+ZYDJ組;B．BJL+ZYDJ組; C．YGW+ZYDJ組;D．ZGW+ZYDJ組

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為“腎生骨髓”、“腎充則髓實(shí)”(《素問·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》)。骨髓藏于髓腔內(nèi)，而BMSCs也存在于骨髓中，與“腎主骨”理論有相似之處。左、右歸丸出自《景岳全書·新方八陣》，是中醫(yī)補(bǔ)腎益精經(jīng)典代表方，左歸丸重在滋陰補(bǔ)腎、填精益髓，右歸丸重在溫補(bǔ)腎陽(yáng)、填精益髓。已有研究證實(shí)，左、右歸丸可促進(jìn)BMSCs的成骨誘導(dǎo)并可通過TGF-β1/ Smad4信號(hào)表達(dá)途徑影響B(tài)MSCs成骨［3-5］。但長(zhǎng)期以來，人們多重視BMSCs成骨誘導(dǎo)方面的研究，疏于對(duì)成脂誘導(dǎo)的研究。有研究表明，髓腔中脂肪細(xì)胞只是填充無造血功能的骨髓空間，后研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的增加伴隨著成骨細(xì)胞的減少［6］，兩者具有此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，提示成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化可能具有共同的作用調(diào)控點(diǎn)［7-8］。國(guó)外學(xué)者提出，通過抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化來防治骨質(zhì)疏松癥的新觀點(diǎn)［9］。國(guó)內(nèi)也有有學(xué)者提出“脂肪細(xì)胞過?！奔僬f，認(rèn)為脂肪細(xì)胞的刺激能造成成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞偶聯(lián)失衡抑制細(xì)胞ALP活性及成骨細(xì)胞增殖［7］。也有研究顯示，部分補(bǔ)腎方藥均不同程度地促進(jìn)成骨分化，抑制成脂分化［［10-12］。故在本次實(shí)驗(yàn)中我們側(cè)重左、右歸丸對(duì)BMSCs成骨及成脂誘導(dǎo)方面的研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果左、右歸丸對(duì)BMSCs分化調(diào)節(jié)有雙向性，即它們?cè)诖龠M(jìn)BMSCs成骨分化的同時(shí)又可抑制BMSCs成脂分化，但兩者差異性還不夠明確，同時(shí)兩方誘導(dǎo)BMSCs成骨、成脂分化的進(jìn)一步機(jī)制也有待深入探究。

［1］ BackesjoCM，LiY，LindgrenU，etal．ActivationofSirt1decreases adipocyteformationduringosteoblastdifferentiationofmesenchymal stemcells［J］．JBoneMinerRes，2006，21(7):993．

［2］ ChristianElabd．ArmelleBasillais，HeleneBeaupied，etal．OxytocinControlsDifferentiationofHumanMesencymalStem CellsandReversesOsteoporosis［J］．StemCell，2008，26，2399．

［3］ 任艷玲，李婭玲，呂海波，等．左歸丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腎臟TGF-β1/Smad4mRNA表達(dá)的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(10):171．

［4］ 宋囡，王智民，任艷玲，等．左、右歸丸及其拆方對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響［J］．中國(guó)病理生理雜志，2013，29(7):1268．

［5］ 蒿長(zhǎng)英，任艷玲，趙金茹．左歸丸含藥血清通過ERK/Smads號(hào)通路干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞的功能基因表達(dá)［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(6):872．

［6］ MaurinAC，ChavassieuxPM，F(xiàn)rappartL，etal．Influenceof matureadipocytesonosteoblastproliferationinhumanprimary cocultures［J］．Bone，2000，26(5):485．

［7］ 宋純理，黨耕町．髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞與骨質(zhì)疏松［J］．中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2002，8(3):266．

［8］ 李良，李東菊，吳江，等．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)理中潛在的作用［J］．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2006，23(1):129．

［9］ NuttallME，GimbleJM．Isthereatherapeuticopportunityto eitherpreventortreatosteopeniedisordersbyinhibitingmarrow adipogenesis?［J］．Bone，2000，27(2):177．

［10］ 程志安，韓凌，危建安，等．六味地黃丸、金匱腎氣丸及健骨二仙丸含藥血清對(duì)BMSCs成脂、成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的影響［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33(2):261．

［11］ 王昌興，董黎強(qiáng)，劉琦，等．濃縮自體骨髓抑制結(jié)合補(bǔ)腎活血中藥對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響［J］．中醫(yī)雜志，2014，55 (8):699．

［12］ 孔西建，吳丹，葉進(jìn)，等．益腎活血法對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者骨密度、骨代謝及脆性骨折發(fā)生率的影響［J］．中醫(yī)雜志，2014，55(5):391．

StudyofZuoguiPillandYouguiPillonOsteogenesisandFatInducedin theRatBoneMarrowMesenchymalStemCell

XUYan1，SONGNan2，RENYan-Ling2△
(1．MedicineCollege，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China;2．CollegeofBasic Medicine，MedicalCollege，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China)

Objective:ToinvestigatetheeffectofZuoGuiWanandYouGuiWaninducedonosteogenesisandadipogenic ofratsbonemarrowstromalstemcells(BMSCs)．Method:PreparethemedicatedserumcontainingZuoGuiWan、YouGuiWan、positivecontroldrug(EstradiolValerate)tosimultaneouslyintervenetheBMSCs．TheALPtestwasmeasured bymodifiedcalicium-combatstainingmethodafterosteogenicinduction．After10daysofadipogenicinduction，oilredO stainingoflipiddropswasusedtodetecttheadipogenicabilityofBMSCs．Results:Zuoguiwan，YouGuiWan，significantly enhancedtheALPactivityoftheBMSCsandthenumberofcalcifiednodules．Zuoguiwan，YouGuiWansignificantlyreduced theformationoftriglyceridelevels．Conclusion:Zuoguiwan，YouGuiWanhavebiphasicregulationofBMSCs，whichcan promoteBMSCsosteogenesisandrestrainBMSCsadipogenicatthesametime．

ZuoGuiWan;YouGuiWan;bonemarrowstromalstemcells;adipogenic;osteogenesis

R285．5

:B

:1006-3250(2015)08-0946-03

2015-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373527)

徐 巖，在讀碩士，從事中藥理論及應(yīng)用研究。

△通訊作者:任艷玲，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事方藥配伍規(guī)律及作用機(jī)制研究，Tel:024-31207267，E-mail: yanlingren@tom．com。