腺苷注射液治療胸部撞擊后肺挫傷的作用機(jī)制

吳衛(wèi)春張麗萍杜峰許堅(jiān)梁治林偉王勝利

腺苷注射液治療胸部撞擊后肺挫傷的作用機(jī)制

吳衛(wèi)春1張麗萍1杜峰1許堅(jiān)1梁治1林偉1王勝利2

目的探討腺苷注射液對撞擊所致肺挫傷的治療作用機(jī)制。方法選取30只健康日本大耳兔，隨機(jī)分為對照組和腺苷注射液治療組，每組15只。用BIM－Ⅱ型生物撞擊機(jī)制備兔肺挫傷模型，分別于撞擊前10min和撞擊后1、3、5、7h采集頸總動脈血，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法檢測丙二醛（MDA）濃度，ELASA試劑盒檢測白介素－10（IL－10）濃度。于傷后7h取下兔右肺，采用比色法檢測肺組織中髓過氧化物酶（MPO）含量，ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液（BALF）中腫瘤壞死因子α（TNF－α）含量，并測定肺泡表面活性物質(zhì)水平。解剖并觀察兔肺大體和顯微病理學(xué)改變。結(jié)果對照組受傷后不同時(shí)間點(diǎn)的血漿MDA濃度、肺組織中MPO含量、BALF中TNF－α濃度和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）活性均較腺苷組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而腺苷治療組血漿IL－10濃度和BALF中總磷脂（TPL）含量均較對照組明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。對照組肺組織實(shí)變明顯，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，大量中性粒細(xì)胞（PMNs）為主的炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞、血小板等聚集，相鄰肺泡間質(zhì)水腫增厚，線粒體腫脹空泡化，微絨毛和板層小體稀少；腺苷組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，可見腺苷治療組肺組織的病理損害明顯較對照組減輕。結(jié)論腺苷注射液對肺挫傷有治療作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)肺挫傷早期炎癥因子濃度有關(guān)。

胸部損傷； 肺； 腺苷注射液

肺挫傷是指由于強(qiáng)大暴力作用于胸壁使胸腔容積縮小，增高的胸內(nèi)壓力壓迫肺臟引起肺實(shí)質(zhì)出血、水腫；外力消除后變形的胸廓回彈，在產(chǎn)生胸內(nèi)負(fù)壓的瞬間又導(dǎo)致原損傷區(qū)附加損傷［1］，可發(fā)生于交通事故、高處墜落、胸部擠壓傷等情況。肺挫傷后常引起低氧血癥、肺水腫、肺出血、肺不張等并發(fā)癥，除傷側(cè)肺損傷外，還可引起對側(cè)肺損害，如不及時(shí)有效地處理會發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），直接威脅患者的生命。然而，臨床上對肺挫傷的治療尚缺乏有效的藥物。目前，腺苷在心胸外科的應(yīng)用仍是個(gè)熱點(diǎn)問題。國內(nèi)外在腺苷預(yù)處理對肺的保護(hù)作用方面已有較深入的研究［2］，但腺苷后處理對肺的作用及其機(jī)制目前尚無研究。因此，本研究擬觀察腺苷對肺挫傷的治療作用，并探討其可能機(jī)制，旨在為臨床救治肺挫傷提供方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、動物分組及模型建立

健康日本大耳兔30只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（SYXK2013－0019），按隨機(jī)數(shù)表法分為對照組（單純撞擊組）和腺苷治療組（撞擊加腺苷注射液干預(yù)組），每組15只，撞擊后立即予等滲鹽水經(jīng)兔耳緣靜脈靜滴維持循環(huán)穩(wěn)定7h，腺苷組于撞擊后30min開始予腺苷針3mg／kg﹒h經(jīng)耳緣靜脈靜滴（腺苷注射液由沈陽光大制藥提供，準(zhǔn)字號H20030320）。參照吳正國等［3］的方法用BIM－Ⅱ型水平式生物撞擊機(jī)制備兔肺挫傷模型。將兔架直立，撞擊兔右側(cè)胸部，撞擊點(diǎn)位于兔右側(cè)第3、4肋間與腋中線交界處，設(shè)置撞擊參數(shù)：采用準(zhǔn)靜態(tài)撞擊，驅(qū)動壓力為650kPa，撞擊面積為4cm2，胸壁壓縮3cm，撞擊時(shí)相為吸氣末。

二、標(biāo)本采集與測定

分別于撞擊前10min和撞擊后1、3、5、7h采集兔頸總動脈血，檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）和白介素－10（interleukin－10，IL－10）的含量。血清MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法；血清IL－10濃度采用ELISA試劑盒測定；于傷后7h取下右肺，取其中的0.1g肺組織采用比色法測定肺組織中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量；按常規(guī)方法收集支氣管肺泡灌洗液（brochoalveolar lavage fluid，BALF），ELISA試劑盒測定BALF中的腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）含量；測定肺泡表面活性物質(zhì)水平，收集BALF，以2層無菌紗布過濾后以1 500r／min離心10min，分離出上清液，分裝后置－20℃環(huán)境中保存待測定，測定總磷脂（total phospholipids，TPL）和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）活性，所有試劑盒均購自上海西塘生物科技有限公司，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。取兔右下肺1cm×1cm×1cm大小的組織進(jìn)行光學(xué)顯微鏡（光鏡）檢查，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法各取兩組中8只兔肺進(jìn)行電子顯微鏡（電鏡）檢查，觀察肺組織的形態(tài)學(xué)改變。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以x珚±s表示，組內(nèi)不同時(shí)相點(diǎn)兩兩比較采用單因素方差分析，組間相同時(shí)相點(diǎn)比較采用成組設(shè)計(jì)的兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿MDA濃度的變化

受傷后對照組動物的血漿MDA濃度明顯升高（F＝7.95，P＜0.01），到受傷后5h達(dá)峰值，以后緩慢下降，受傷后7h濃度仍然高于受傷前（F＝6.85，P＜0.01）；腺苷治療組血漿MDA濃度變化規(guī)律類似于對照組，但其濃度明顯低于對照組，峰值也顯著低于對照組（t＝8.87，P＜0.01），至傷后7h即降至受傷前水平（表1）。

二、血漿IL－10濃度的變化

對照組血漿IL－10濃度在受傷后逐漸降低，受傷后5h達(dá)最低值為（0.058±0.003）pg／ml（F＝5.65，P＜0.01），此后有所回升，但受傷后7h仍明顯低于受傷前水平（F＝6.15，P＜0.01）；腺苷組血漿IL－10濃度變化過程與對照組類似，但降低幅度明顯較對照組小，受傷后7h已恢復(fù)到受傷前水平（P＞0.05）（表2）。

三、肺組織中MPO和BALF中TNF－α、NE活性、TPL水平比較

腺苷治療組肺組織MPO含量較對照組明顯降低（t＝3.86，P＜0.01）；BALF中NE活性和TNF－α濃度均較對照組顯著降低（t＝5.75，P＜0.01；t＝3.69，P＜0.01），但TPL含量較對照組顯著升高（t＝6.45，P＜0.01）（表3）

四、兩組肺組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

對照組大體觀察可見肺組織實(shí)變明顯，表面有散在紅色斑片，光鏡下肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分萎縮，大量中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear cells，PMNs）為主的炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞、血小板等聚集（圖1A）；電鏡下Ⅱ型細(xì)胞部分破壞，相鄰肺泡間質(zhì)水腫增厚，線粒體腫脹空泡化，微絨毛和板層小體稀少（圖1B）。腺苷治療組光鏡下肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，PMNs減少（圖2A）；電鏡下肺泡Ⅱ型細(xì)胞形態(tài)基本正常，肺泡壁薄，肺泡間隔輕度水腫，線粒體無明顯腫脹，微絨毛較多，板層小體豐富（圖2B）。

表1 兩組兔血漿丙二醛（MDA）濃度的變化（珚±s，nmol／ml）

表1 兩組兔血漿丙二醛（MDA）濃度的變化（珚±s，nmol／ml）

受傷后組別兔數(shù)受傷前.29 23.00±2.58腺苷治療組15 15.11±1.69 15.90±2.20 16.26±1.52 16.71±2.62 15.28±2.08 t值1h3h5h7h對照組15 15.01±1.98 21.90±3.07 22.86±3.11 24.95±1 1.21 5.12 5.78 8.87 6.59 P值＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 兩組兔血漿白介素－10（IL－10）濃度的變化（珚±s，pg／ml）

表2 兩組兔血漿白介素－10（IL－10）濃度的變化（珚±s，pg／ml）

受傷后組別兔數(shù)受傷前8±0.003 0.062±0.002腺苷治療組15 0.084±0.003 0.079±0.001 0.073±0.003 0.075±0.002 0.080±0.001 t值1h3h5h7h對照組15 0.090±0.002 0.071±0.003 0.066±0.001 0.05 1.32 2.58 3.42 3.54 1.94 P值＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01＞0.05

表3 兩組兔肺組織指標(biāo)比較（珚±s）

表3 兩組兔肺組織指標(biāo)比較（珚±s）

注：MPO表示髓過氧化物酶（myeloperoxidase），BALF表示支氣管肺泡灌洗液（bronchalveor lavage fluid）；TNF－α表示腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor－α）；NE表示彈性蛋白酶（neutrophilelastase），TPL表示總磷脂（total phospholipids）

組別兔數(shù)MPO（IU／g）TNF－α（μg／L）NE（IU／ml）TPL（μg／g）.71腺苷治療組15 0.70±0.41 0.58±0.22 7.92±3.55 518.92±66.14 t值對照組15 1.25±0.69 1.12±0.45 15.11±4.37 235.58±43 0.01 3.86 3.69 5.75 6.45 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜

圖1 對照組肺組織細(xì)胞改變。1A：光鏡下觀察，HE染色×100；1B：電鏡下觀察×10 000 圖2 腺苷組肺組織細(xì)胞改變。2A：光鏡下觀察，HE染色×100；2B：電鏡下觀察×10 000

討 論

目前胸部撞擊后肺挫傷的機(jī)制尚不完全清楚。血漿MDA為自由基脂質(zhì)過氧化的醛式產(chǎn)物，是脂質(zhì)過氧化代謝的主要中間產(chǎn)物，其醛基能與血管內(nèi)皮、神經(jīng)元等細(xì)胞生物膜磷脂中的氨基組分發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)，使生物膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引起膜通透性增加、膜上的Na＋－K＋－ATP酶失活、線粒體功能障礙等，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載，并激發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成惡性循環(huán)。本研究用硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量，不僅反映了氧自由基生成與否及其清除情況，還反映出氧自由基造成組織損傷的嚴(yán)重程度。血漿IL－10是一種抗炎癥細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的抗感染作用，可以抑制某些因子如IFN－γ、IL－1－β、IL－2、TNF－α等的合成及活性，降低它們各自的mRNA水平和黏附分子的表達(dá)［4］；同時(shí)它又對抗炎癥物質(zhì)如IL－1Ra具有正向調(diào)節(jié)作用，提高它的濃度和活性。MPO是PMNs胞質(zhì)中的一種特異性酶，肺組織中MPO活性的變化可反映PMNs在肺組織的聚集程度，它標(biāo)志著PMNs的活化和聚集?！昂粑l(fā)”是激活的PMNs釋放氧自由基的方式，釋放的氧自由基引起肺組織脂質(zhì)過氧化損傷，同時(shí)釋放彈性蛋白酶、溶酶體酶等損傷和破壞肺組織結(jié)構(gòu)導(dǎo)致肺水腫。TNF－α由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞釋放，它是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，能參與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。TNF－α可以引起體內(nèi)一系列的病理反應(yīng)，如誘導(dǎo)PMNs的“呼吸爆發(fā)”；刺激多種細(xì)胞因子的生成、釋放，參與到肺水腫的形成；表達(dá)細(xì)胞黏附分子，激活白細(xì)胞黏附活性［5］。Rajamani等［6］通過對肺挫傷患者的BALF分析，發(fā)現(xiàn)肺挫傷導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生成和分泌的表面活性物質(zhì)減少；同時(shí)以TNF－α為主的肺泡內(nèi)的炎性因子使表面活性物質(zhì)降解加速。PS的減少和呼吸道內(nèi)分泌物的阻塞促使肺不張的發(fā)生。肺不張一方面影響肺的通氣換氣功能，另一方面又進(jìn)一步加重肺部炎癥反應(yīng)，并形成惡性循環(huán)，加重肺損傷。

外源性腺苷不是作為能量底物發(fā)揮作用，而主要作用于腺苷受體，其可能的機(jī)制為：①抑制PMNs、內(nèi)皮細(xì)胞及其相互作用：國外有人發(fā)現(xiàn)，腺苷可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［7］，而且腺苷可抑制PMNs的CD11／CD18表達(dá)和抑制血小板活化因子［8］。②減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載：腺苷激活A(yù)1受體，開放ATP敏感性鉀通道（ATP－sensitive potassium channel，KATP），通過電壓依賴性Ca2＋通道，降低Ca2＋內(nèi)流，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)ATP［9］，該作用可被KATP通道阻滯劑所阻斷［10］足以證明這一點(diǎn)。③腺苷可以有效恢復(fù)高能磷酸儲備。④腺苷還可以抑制血小板的聚集，防止血栓的形成：有人通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)腺苷能降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制血栓烷素A2的釋放，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，并且通過降低細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，抑制Ca2＋誘發(fā)的血小板聚集。⑤腺苷的抗氧化作用：Rupprecht等［11］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺苷對氧自由基有顯著的抑制作用，比如，腺苷可通過腺苷A2受體使PMNs產(chǎn)生的超氧陰離子減少。

本研究結(jié)果顯示，胸部撞擊致肺挫傷早期，對照組血漿MDA濃度、肺組織中MPO含量以及BALF中TNF－α濃度、NE活性較腺苷治療組顯著升高，而腺苷治療組血漿IL－10濃度和BALF中TPL含量較對照組明顯高，同時(shí)腺苷治療組肺組織的病理損害明顯較對照組減輕。提示胸部撞擊后血漿MDA、肺組織中MPO、BALF中TNF－α濃度和NE活性升高，以及血漿IL－10濃度、BALF中TPL含量下降都可能加重肺挫傷，而腺苷可以通過調(diào)節(jié)它們的濃度變化來減輕胸部撞擊后繼發(fā)的肺損傷。

1 王正國.我國道路交通傷的現(xiàn)狀［J］，中華創(chuàng)傷雜志，2000，16（4）：200－201.

2 劉勇，賀春熙.腺苷預(yù)處理對小兒體外循外肺損傷的保護(hù)作用［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（5）：77－79.

3 吳正國，梁貴友，李正勛，等.參芪扶正注射液對心肌挫傷后家兔心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（7）：588－591.

4 Avdic S，Cao JZ，McSharry BP，et al.Human cytomegalovirus interleukin－10polarizes monocytes toward a deactivated M2c phenotype to repress host immune responses［J］.J Virol，2013，87（18）：10273－10282.

5 Vinokurov M，Ostrov V，Yurinskaya M，et al.Recombinant human Hsp70protects against lipoteichoic acid－induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels［J］.Cell Stress Chaperones，2012，17（1）：89－101.

6 El－Awady MS，Rajamani U，Teng B，et al.Evidence for the involvement of NADPH oxidase in adenosine receptors－mediated control of coronary flow using A1and A3knockout mice.［J］.Physiol Rep，2013，1（3）：163－170.

7 Zhao ZQ，Nakamura M，Wang NP，et al.Administration of adenosine during reperfusionreduces injury of vascular endothelium and death of myocytes［J］.Coron Artery Dis，1999，10（8）：617－628.

8 Kaji W，Tanaka S，Tsukimoto M，et al.Adenosine A（2B）receptor antagonist PSB603suppresses tumor growth and metastasis by inhibiting induction of regulatory T cells［J］.J Toxicol Sci，2014，39（2）：191－8.

9 Lochner A，Marais E，Huisamen B，et al.Protection of the ischaemic heart：investigations into the phenomenon of ischaemic preconditioning［J］.Cardiovasc J Afr，2009，20（1）：43－51.

10 G Kounis N，Soufras GD，Tsigkas G，et al.Adverse cardiac events to monoclonal antibodies used for cancer therapy：The risk of Kounis syndrome［J］.Oncoimmunology，2014，14（3）：e27987.

11 Rupprecht H，Ghidau M.Penetrating nail－gun injury of the heart managed by adenosine－induced asystole in the absence of a heart－lung machine.［J］.Tex Heart Inst J，2014，41（4）：429－432.

Mechanism of adenosine injection in treatment of lung contusion following chest impact

Wu Weichun1，Zhang Liping1，Du Feng1，Xu Jian1，Liang Zhi1，Lin Wei1，Wang Shengli2.
1Department of Cardiothoracic Surgery，Yuhang Hospital，Hangzhou Normal University College of Medicine，Hangzhou 311100，China；2Department of Cardiothoracic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China

Wu Weichun，Email：zjwuweichun＠163.com

ObjectiveTo investigate the mechanism of adenosine injection in treatment of lung contusion following chest impact.MethodsThirty healthy Japanese big－ear rabbits were randomly assigned to control groupand adenosine injection treatment group，with 15rabbits in each group.The lung contusion model was prepared by BIM－Ⅱbioimpact machine.Blood samples were taken from common carotid artery 10min before impact and 1h，3h，5hand 7hafter impact，the plasma concentrations of malondialdehyde（MDA）were measured by thiobarbituric acid（TBA）method，and the levels of interleukin－10（IL－10）were determined by ELISA.The right lungs of rabbits were obtained 7h after injury，the contents of myeloperoxidase（MPO）in lung tissues were decected by colorimetric assay，the concentrations of tumor necrosis factorα（TNF－α）in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were examined by ELISA，and levels of alveolus surface active substance were also determined.The gross and microscopic appearance was observed.ResultsThe concentration of plasma MDA，content of MPO in lung tissues，concentrations of TNF－αand activity of neutrophil elastase（NE）in BALF in control group were significantly higher than those in adenosine injection treatment group（P＜0.05or P＜0.01）.However，the plasma concentration of IL－10and content of total phospholipids（TPL）in BALF in adenosine injection treatment group were significantly higher than those in control group（P＜0.05or P＜0.01）.The morphological observation found serious lung consolidation in control group，with damaged alveolar structure and congregation of large amount of inflammatory cells，red blood cells and blood platelets，while revealed almost normal alveolar structure in adenosine injection treatment group，which indicated that the injury in adenosine injection treatment group was less severe than that in control group.ConclusionsAdenosine injection has a therapeutic effect onlung contusion，the mechanism of which may be related to the regulation of inflammatory factors in the early stage of lung contusion.

Thoracic injury；Lung；Adenosine injection

2015－05－12）

（本文編輯：周珠鳳）

10.3877／cma.j.issn.2095－8773.2015.03.012

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012B029）

311100 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院余杭分院，余杭第一人民醫(yī)院心胸外科1；325035 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心胸外科2

吳衛(wèi)春，Email：zjwuweichun＠163.com

吳衛(wèi)春，張麗萍，杜峰，等.腺苷注射液治療胸部撞擊后肺挫傷的的作用機(jī)制［J／CD］.中華胸部外科電子雜志，2015，2（3）：197－201.