tDCS對中風(fēng)大鼠功能恢復(fù)和Notch信號(hào)通路的影響

段軍秀，鄭嵋戈，穆淑花，田大勝，許新忠，賀震旦，張 健

1)深圳大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518060；2)明斯特大學(xué)生物物理及生物醫(yī)學(xué)研究所，德國明斯特 48149；3)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，安徽合肥230601；4)深圳大學(xué)心理學(xué)院，廣東深圳518060

腦卒中是臨床上較常見的一種突發(fā)性腦血管疾病.腦卒中發(fā)病時(shí)，腦動(dòng)脈突然被阻塞，造成局部腦組織供血不足，導(dǎo)致該區(qū)域腦組織受損，影響機(jī)體的神經(jīng)功能.ZHAO等[1]研究表明，在缺血再灌注的腦組織中，Notch信號(hào)通路被顯著激活，參與腦缺血后的病理改變及功能恢復(fù)過程.Notch信號(hào)通路是一個(gè)進(jìn)化高度保守的信號(hào)通路，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間信號(hào)交換，影響神經(jīng)發(fā)育過程中的細(xì)胞分化、增殖與凋亡等多種程序，并在神經(jīng)功能的恢復(fù)過程中起十分重要的作用[2].Notch1是Notch信號(hào)通路的受體蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞分化，同時(shí)控制著突觸蛋白可塑性變化.Notch1的胞內(nèi)接頭蛋白NICD(Notch intracellular domain)及下游轉(zhuǎn)錄因子RBP-JK(recombination signal binding protein-JK)調(diào)控著細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等過程[3].上述基因的表達(dá)水平常作為Notch信號(hào)通路激活的重要標(biāo)志.

經(jīng)顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation, tDCS)作為無創(chuàng)性腦刺激技術(shù)之一，具有獨(dú)特優(yōu)勢，而且安全性高.臨床研究表明，tDCS在肢體運(yùn)動(dòng)功能提高、記憶能力改善和神經(jīng)功能恢復(fù)等方面具有可觀的療效[4].但是，tDCS的潛在神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍然知之甚少，因此也阻礙了其在臨床中的應(yīng)用.本研究在中風(fēng)大鼠雙眼眶上孔和眶下緣和鼻交點(diǎn)處采用模擬臨床的tDCS療法，研究tDCS對中風(fēng)大鼠功能恢復(fù)和Notch信號(hào)通路的影響，以期為tDCS的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)采用成年SD(sprague dawley)大鼠，質(zhì)量為250～300 g.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購買及飼養(yǎng)均經(jīng)過深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)動(dòng)物房，且自由覓食進(jìn)水.模型制作前24 h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為4組：① 模型組，即中腦動(dòng)脈閉塞(middle cerebral arterial occlusion, MCAO)(n=18只)；② 治療組MCAO+tDCS(n=18只)；③ 假手術(shù)組sham(n=9只)；④ 假治療組sham+tDCS(n=9只).① 和 ② 組每組9只用于2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazole chloride, TTC)染色，9只用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)實(shí)驗(yàn).假手術(shù)組和假治療組各9只用于RT-PCR實(shí)驗(yàn).所有大鼠在造模后取材前都參加行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)，每組分別于造模后5、10和15 d取材.

1.2 大腦中動(dòng)脈栓塞模型

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉80 mg/kg麻醉.造模方法參考文獻(xiàn)[5]，線拴采用進(jìn)口魚線，剪成3 cm 長度，用記號(hào)筆在1.8～2.0 cm處進(jìn)行標(biāo)記，將頭部5 mm在石蠟中沾一下進(jìn)行包被，用蒸餾水清洗晾干紫外消毒30 min后放入無菌多聚賴氨酸中浸泡10 min.頸前部皮膚去毛消毒，做頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，并分別穿線備用.在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎(確保殘端長度不小于0.5 cm)將頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈用動(dòng)脈夾夾閉阻斷，用手術(shù)剪在頸外動(dòng)脈靠近結(jié)扎處做一個(gè)橫向切口，將處理好的線栓從右側(cè)頸總動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，用事先穿好的手術(shù)線打結(jié)系住線栓和血管，使之不易脫出.從切口處剪斷頸外動(dòng)脈殘端，牽拉頸外靜脈殘端與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，松開頸內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈夾，通過向大鼠左上方提拉環(huán)繞頸內(nèi)動(dòng)脈的手術(shù)線調(diào)整線栓插入的角度，將線栓送入頸內(nèi)動(dòng)脈18～20 mm(記號(hào)筆標(biāo)記處)，感覺有阻力時(shí)停止插入線栓.扎緊手術(shù)線，固定線栓位置.松開頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾.栓塞大鼠大腦中動(dòng)脈2 h，期間大鼠體溫保持在(37±1)℃.輕輕拔除線栓，手術(shù)線扎緊頸外動(dòng)脈殘端，縫合傷口，實(shí)現(xiàn)再灌注.假手術(shù)組大鼠麻醉后僅暴露頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分支，不栓塞大腦中動(dòng)脈.

1.3 經(jīng)顱直流電刺激

實(shí)驗(yàn)采用深圳創(chuàng)信醫(yī)療有限公司的腦反射治療儀，結(jié)合該儀器在臨床治療過程中的使用方法和參數(shù)，大鼠在造模后24 h開始接受tDCS治療，每次治療前對大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行淺麻醉(40 mg/kg)，大鼠俯臥于舒適臺(tái)面上，將探頭安裝在大鼠雙眼眶上孔、眶下緣與鼻翼交匯點(diǎn)，探頭上的導(dǎo)電介質(zhì)調(diào)整到最佳位置，避免介質(zhì)滲入眼睛，如圖1(a)和(b).首次治療電壓不超過30 V、(50±2%)Hz；第2次以后手動(dòng)增幅使電壓保持在(30±3)V，持續(xù)時(shí)間為15 min，治療過程中大鼠會(huì)出現(xiàn)眼匝輪肌節(jié)律收縮，隨著電壓幅值增大還伴有口匝輪肌收縮現(xiàn)象.每隔24 h治療1次，最后1次tDCS治療結(jié)束30 min后處死動(dòng)物取材.假手術(shù)組與模型組只安置頭部探頭，不給予電流.

圖1 電刺激裝置及位置

1.4 神經(jīng)功能損傷評(píng)估

治療前后神經(jīng)功能的變化采用神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評(píng)分(modified neurological severity score, mNSS)進(jìn)行評(píng)估[6].對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在造模前一天及造模后每24 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，持續(xù)到該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被處死.該量表能夠精確的反映整個(gè)tDCS治療過程中每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物康復(fù)過程中神經(jīng)功能的變化.該評(píng)分量表主要包括：運(yùn)動(dòng)能力、感知能力、平衡能力和曲張能力，評(píng)分為0～18分，正常大鼠評(píng)分為0，損傷最嚴(yán)重的為18分，測試的各項(xiàng)目中如果大鼠無法完成相應(yīng)實(shí)驗(yàn)就得1分，能夠順利完成不得分，評(píng)分越高，表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重.

1.5 缺血面積計(jì)算

實(shí)驗(yàn)中采用TTC染色的方法計(jì)算缺血面積.TTC能夠與腦組織中活性的脫氫酶反應(yīng)，染色后腦組織呈紅色；而腦缺血后，腦組織中脫氫酶活性下降，染色后腦組織呈白色.大鼠過量麻醉后取新鮮腦組織，用生理鹽水洗去表面血漬后將腦組織于-20 ℃冰箱中放置15 min后取出，用鋒利的刀片將腦組織冠狀連續(xù)切片，厚度約2 mm.將腦切片浸入體積分?jǐn)?shù)為1%的生理鹽水配置的TTC溶液中，避光，37 ℃孵育15 min后取出拍照.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行分析[7].缺血面積S計(jì)算公式為

S=[(Vc-VL)/Vc]×100%

(1)

其中，Vc為對照一側(cè)半腦的體積；VL為缺血一側(cè)正常腦組織的體積.

1.6 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

腦組織總核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)提取采用TRIzol試劑盒(購自美國Invitrogen公司)提供的提取步驟，各組大鼠深度麻醉后，取新鮮腦組織，分離出海馬和紋狀體，將組織剪碎后按組織重量每100 mg加入1 mL RNase plus，將組織研磨充分后離心，取上清溶液，加入氯仿(RNase plus和氯仿體積比為5∶1)，劇烈震蕩后室溫靜置5 min，離心取上清液.向上清液中加入等體積的異丙醇溶液，充分混勻后室溫靜置10 min.離心后棄上清，沿離心管壁緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇1 mL，輕輕上下顛倒充分洗滌離心管壁殘留的提取液，離心后小心吸出乙醇，室溫放置5 min使沉淀完全干燥后加入適量的RNase-free水，用酶標(biāo)儀檢測RNA濃度，隨后于-80 ℃保存.用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國Takara公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complement deoxyribonucleic acid, cDNA).逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(購自美國Takara公司)進(jìn)行定量分析.每40 ng cDNA模版加入實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒中的2×SYBP green mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，并加入7.2 μL無RNA酶的水，使反應(yīng)體系最終體積為20 μL.整個(gè)擴(kuò)增過程采用兩步法：NeuN，GFAP,SYP采用95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，55 ℃，20 s；共40個(gè)循環(huán).Notch信號(hào)通路的檢測采用95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，20 s；共45個(gè)循環(huán).引物序列如表1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法，即

表1 RT-PCR所用的引物序列

△△Ct=(Ct治療組目的基因-Ct治療組β-actin)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組β-actin)

(2)

其中，Ct治療組目的基因?yàn)橹委熃M相應(yīng)基因的閾值循環(huán)；Ct治療組β-actin為治療內(nèi)參基因的閾值循環(huán)；Ct對照組目的基因?yàn)榧僦委熃M相應(yīng)基因的閾值循環(huán)；Ct對照組β-actin為假治療組內(nèi)參基因的閾值循環(huán).

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 tDCS促進(jìn)大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)

為研究tDCS是否促進(jìn)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能改善，研究采用mNSS的方法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能測試.神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，sham組和sham+tDCS組的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分接近為0，說明假手術(shù)并未對大鼠神經(jīng)功能造成損傷，也同時(shí)證明了tDCS治療方法的安全性，如圖2(a).與MCAO組相比，MCAO+tDCS組在術(shù)后第5天，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，如圖2(a)，在術(shù)后第9～15天神經(jīng)功能缺損也明顯改善，如圖2(a).以上結(jié)果表明，tDCS治療能促進(jìn)大鼠腦缺血后功能的恢復(fù).

圖2 經(jīng)顱直流電刺激治療對中風(fēng)大鼠神經(jīng)功能和腦梗死面積的影響

2.2 tDCS治療能夠縮減受累腦區(qū)的腦缺血面積

為研究tDCS治療對大鼠腦缺血面積是否有所改善，本研究采用TTC染色法，對術(shù)后第5、10和15 d腦缺血面積改變情況進(jìn)行觀察比較.結(jié)果顯示：MCAO組在術(shù)后第5天，患側(cè)受累腦區(qū)包括基底節(jié)外側(cè)區(qū)、頂葉和顳葉(部分區(qū)域)，且腦組織有輕微水腫，缺血面積為(36.13±5.50)%，如圖2(b)和(c)；術(shù)后第10天，腦組織水腫消退，腦缺血面積為(36.68±5.43)%，如圖2(b)和(c)；術(shù)后第15天，患側(cè)受累腦區(qū)減小，腦缺血面積為(35.03±5.08)%，如圖2(b)和(c).與MCAO組相比，MCAO+tDCS組在術(shù)后第5天患側(cè)受累腦區(qū)缺血面積沒有顯著性減小.術(shù)后第10天，MCAO+tDCS組缺血面積減少為(27.30±2.04)%(P<0.05)，如圖2(b)和(c)；術(shù)后第15天，與MCAO組相比，MCAO+tDCS組缺血面積下降了(7.36±1.95)%，如圖2(b)和(c)，差異顯著(P<0.05)，如圖1(b)和(c).以上數(shù)據(jù)表明，tDCS能夠減小患側(cè)受累腦區(qū)的缺血面積.

2.3 tDCS能夠促進(jìn)Notch信號(hào)通路受體蛋白及下游轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)

為研究腦缺血后tDCS治療對Notch信號(hào)通路的影響，采用RT-PCR技術(shù)，檢測各組腦組織紋狀體和海馬區(qū)中Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1的基因表達(dá)變化.結(jié)果表明，上述基因的mRNA表達(dá)在MCAO組和MCAO+tDCS組均顯著高于sham組和sham+tDCS組；而后兩組之間沒有明顯差異，如圖3(a)、(b)、(c)和(d).術(shù)后第5天，在大鼠的紋狀體與海馬區(qū)，與MCAO組相比，MCAO+tDCS組上述4個(gè)基因表達(dá)量沒有顯著性差異，如圖3；術(shù)后第10天，與MCAO組相比，MCAO+tDCS組中Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1的mRNA表達(dá)變化在紋狀體區(qū)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異如圖3(e)、(f)、(g)和(h)，而在海馬區(qū)Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1基因的表達(dá)卻顯著上調(diào)，如圖3(a)、(b)、(c)和(d)；術(shù)后第15天，與MCAO組相比，MCAO+tDCS組Notch信號(hào)通路中Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1在紋狀體區(qū)mRNA表達(dá)量均有所增加，如圖3(e)、(f)、(g)和(h)，而在海馬區(qū)Notch1和 Hes-1的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，如圖3(a)和(d)；與MCAO組相比，MCAO+tDCS組NICD與RBP-JK的mRNA表達(dá)量也有顯著性差異，如圖3(b)和(c).結(jié)果顯示，大鼠腦缺血后能夠激活Notch信號(hào)通路，tDCS促使Notch信號(hào)通路受體及下游轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)上調(diào).

3 討 論

綜上研究結(jié)果表明，采用多導(dǎo)腦反射儀治療作用在雙眼眶上孔和眶下緣以及鼻交點(diǎn)處的經(jīng)顱直流電刺激療法可以顯著減少腦梗死體積，從而改善中風(fēng)后功能恢復(fù).本研究可為經(jīng)顱直流電刺激的治療提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

經(jīng)顱直流電刺激已被視為有效輔助療法，可加快中風(fēng)后神經(jīng)功能的恢復(fù).經(jīng)顱直流電刺激通過改變靜息膜電位來調(diào)節(jié)自發(fā)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)[4]，這種活動(dòng)取決于電極的位置[8-9].許多研究集中在經(jīng)顱直流電刺激對運(yùn)動(dòng)皮層的影響上，因?yàn)榻?jīng)顱直流電刺激在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的恢復(fù)中起著重要作用，例如肢體運(yùn)動(dòng)和記憶力的改善[10-11].但其機(jī)制仍不清楚.本研究中，刺激區(qū)域是雙眼眶上孔和眼眶下緣與鼻翼的交點(diǎn).通過刺激三叉神經(jīng)上頜、下頜和眼神經(jīng)的分支叢，神經(jīng)興奮被傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)皮層，并將神經(jīng)興奮傳遞到損傷部位以達(dá)到治療效果.在刺激過程中可觀察到大鼠面部肌肉群和肢體肌肉群有規(guī)律的震顫.結(jié)果表明，建模5～15 d，mNSS得分在0～2分變化.治療后，mNSS評(píng)分為6～9分，仍處于中度損傷，但是治療組的改善明顯優(yōu)于對照組.同時(shí)TTC染色顯示治療組缺血面積較模型組明顯減小.

腦梗塞后神經(jīng)功能恢復(fù)涉及的信號(hào)通路多種多樣.已經(jīng)有研究證明Notch信號(hào)通路與大鼠腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的存活[12]、分化和遷移密切相關(guān)[13].本研究以tDCS為干預(yù)手段，檢測大鼠腦缺血治療前后Notch下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化.Notch1是一個(gè)跨膜蛋白，已有研究數(shù)據(jù)顯示，Notch1過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]，同時(shí)Notch1的激活能調(diào)控和神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖和分化[15].實(shí)驗(yàn)中Notch信號(hào)通路被激活，治療組中Notch1的mRNA表達(dá)在紋狀體區(qū)和海馬區(qū)明顯上調(diào)，有顯著性差異的時(shí)間出現(xiàn)在造模后第15天(圖3).說明tDCS治療能夠促進(jìn)Notch1基因的高表達(dá).Hes-1是Notch信號(hào)通路下游的一個(gè)調(diào)控因子，能夠有效地調(diào)控神經(jīng)元的遷移[16]，細(xì)胞中如果過量表達(dá)NICD則能夠增加新生細(xì)胞的存活率，如果細(xì)胞中缺少Hes-1蛋白，則會(huì)加速神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[2].研究發(fā)現(xiàn)，tDCS能夠使海馬區(qū)Hes-1基因在治療后mRNA表達(dá)量上調(diào)，如圖3(h)，與此相對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示tDCS加速大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，如圖2(a).WANG等[17]研究表明，Notch信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)中風(fēng)后成熟的神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖和分化，在這個(gè)過程中Notch信號(hào)通路相關(guān)因子高表達(dá).采用Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT和siRNA能夠使NICD、Notch1和Hes-1表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)使神經(jīng)元數(shù)量減少.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，tDCS干預(yù)的腦缺血大鼠在神經(jīng)功能恢復(fù)過程中Notch信號(hào)通路的受體及下游轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致.本研究未對Notch信號(hào)通路進(jìn)行阻斷，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)不足以證明tDCS促進(jìn)的Notch信號(hào)通路中Notch1、NICD、RPB-JK和Hes-1的mRNA表達(dá)上調(diào)與神經(jīng)功能恢復(fù)呈正相關(guān).但是現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)說明，大鼠腦缺血后能夠激活Notch信號(hào)通路并參與腦缺血損傷的修復(fù)，同時(shí)tDCS有助于進(jìn)一步提高該通路中Notch1、NICD、RPB-JK和Hes-1的mRNA表達(dá).

圖3 tDCS提高Notch信號(hào)通路受體及下游轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)

結(jié) 語

本研究使用線拴法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞腦缺血再灌注模型，采用神經(jīng)功能評(píng)分量表觀察治療前后大鼠神經(jīng)行為學(xué)，神經(jīng)功能的變化，依據(jù)TTC染色差異比較治療前后大鼠腦缺血面積的改善情況，并結(jié)合RT-PCR技術(shù)，從組織和細(xì)胞分子層面研究tDCS作用機(jī)制.結(jié)果表明，tDCS使Notch信號(hào)通路中Notch1、NICD、RPB-JK和Hes-1基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)減少了缺血大鼠的缺血面積并加速缺血性中風(fēng)后功能的恢復(fù).該研究為經(jīng)顱直流電刺激促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能康復(fù)提供了部分實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù).與其他研究方法相比，該方法簡化了治療步驟.因此，可將該設(shè)計(jì)前瞻性地發(fā)展為一種臨床治療方式，且僅通過戴上類似目鏡的設(shè)備就能使患者得到治療.